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प्रोटिओमिक्स से कंकाल की मांसपेशी लैंगिक द्विरूपता

Published: December 14, 2011 doi: 10.3791/3536
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Center for Proteomics, Smith College, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Chemistry, Smith College, 4Department of Biological Sciences and Center for Proteomics, Smith College

Summary

तरीकों का एक सेट सीधे आगे के लिए अलग और सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त पहचान निर्धारित है. 800 स्पॉट के बारे में 10 मिलीग्राम मांसपेशियों से एक दो आयामी जेल पर discerned हैं, यह लिंग विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है. इन विधियों सबसे ऊतकों में बराबर परिणाम दे देंगे.

Abstract

कंकाल की मांसपेशी में सकल संकुचन मुख्य रूप से सिकुड़ा प्रोटीन की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन इस ऊतक भी उल्लेखनीय प्रतिरोध व्यायाम और अप्रचार द्वारा शोष द्वारा अतिवृद्धि जैसे पर्यावरणीय कारकों एक अनुकूलनीय है. यह इस प्रकार तनाव (गर्मी, ischemia, भारी धातुओं, आदि.) 2,3 करने के लिए remodeling और रूपांतरों को दर्शाती है. मांसपेशियों को नुकसान की मांसपेशियों exerting बल द्वारा होते हैं, जबकि लंबी कर सकते हैं, तथाकथित सनकी संकुचन 4. सिकुड़ा प्रोटीन जैसे exertions में क्षतिग्रस्त हो सकता है और करने के लिए, अपमानित और / या resynthesized मरम्मत की जरूरत है, इन कार्यों सिकुड़ा प्रोटीन का हिस्सा नहीं हैं, लेकिन सेल में अन्य बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की. यह निर्धारित करने के लिए क्या प्रोटीन का सबसेट क्षति के इस प्रकार के सुधार में शामिल है, एक वैश्विक proteome पहले स्थापित किया जाना चाहिए करने के लिए 5 व्यायाम और तब व्यायाम के बाद पीछा अंतर निर्धारित करने के लिएप्रोटीन अभिव्यक्ति और जिससे रूपांतरों में नुकसान और इसकी मरम्मत के लिए उम्मीदवार प्रोटीन पर प्रकाश डाला. इसके अलावा, प्रजातियों के नर कंकाल की मांसपेशी के सबसे अधिक अध्ययन आयोजित किया गया है और इसलिए महिला की मांसपेशी के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है.

इस अनुच्छेद में हम प्रोटीन reproducibly पुरुष और महिला की मांसपेशियों से निकालने और उन्हें दो आयामी जेल उच्च संकल्प डिजिटल इमेजिंग 6 द्वारा पीछा वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह स्पॉट (और बाद में पहचान प्रोटीन) है कि इस शो के लिए एक प्रोटोकॉल है एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) दो गुना वृद्धि या कमी दिखाई देते हैं, या नियंत्रण राज्य से गायब है. प्रदान करता है ये तो, excised trypsin के साथ पचा और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन (नियंत्रण रेखा / एमएस / एमएस) की पहचान 5 के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमीटर (नियंत्रण रेखा / एमएस) के लिए मिलकर द्वारा अलग. इस पद्धति (चित्रा 1) कोई संशोधन के लिए थोड़ा के साथ कई ऊतकों पर इस्तेमाल किया जा सकता है (लीवर, मस्तिष्क, सुनआदि.) टी.

Protocol

1. नमूना तैयार

  1. सामग्री शुरू करने के रूप में चूहों से ताजा, फ़्लैश जमी या RNAlater इलाज ऊतक का उपयोग करें. दूर आगे बढ़ने से पहले एक Kimwipe के साथ किसी भी अतिरिक्त संरक्षक ब्लाट.
  2. और सभी मांसपेशियों के आसपास कण्डरा प्रावरणी निकालें और ठंडा गिलास प्लेट पर 2 मिनट के लिए एकल (4 डिग्री सेल्सियस) एक ठंडे कमरे में धार रेज़र ब्लेड के साथ ऊतक कीमा जब तक ऊतक अच्छी तरह कीमा बनाया हुआ या ख़स्ता है. एक पूर्व तौला microfuge ट्यूब में नमूना ले लीजिए और ऊतक के वजन का निर्धारण. अपने प्रारंभिक सामग्री के रूप में में ऊतक के कोई 10 से अधिक मिलीग्राम का प्रयोग करें.
  3. 45 μL प्रति 1 मिलीग्राम कीमा बनाया हुआ ऊतक निष्कर्षण (8 एम यूरिया, 50 मिमी डीटीटी, 4% chaps, 0.2% वाहक ampholytes 5 / 8, .0002% bromophenol नीले) कमरे के तापमान पर, बफर जोड़ें. यदि मात्रा 350 μL से अधिक है, 350 μL शुरू जोड़ने और homogenize (1.4 कदम), तो बफर के बाकी जोड़ने के लिए splashing कम से कम.
  4. ऊतक में 15 सेकंड के लिए एक motorized मूसल (Kontes कॉर्प) के साथ सात बार homogenize4 डिग्री सेल्सियस, दो मिनट प्रत्येक homogenization के बीच बर्फ पर ठंडा के साथ.
  5. 4 में 30 मिनट के लिए 15,600 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला सहेजें और इसकी मात्रा को मापने. सेल मलबे गोली खारिज कर दिया है.
  6. बर्फ ठंड एसीटोन अभिकर्मक ग्रेड (ध् अनुपात: 3 बार v) के साथ सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन वेग. 15 सेकंड के लिए ट्यूबों भंवर. 10 सेकंड के लिए 15,600 XG छर्रों फार्म, और Kontes मोटर और polypropylene भावप्रवण छड़ (BioSpec प्रॉड) के साथ निष्कर्षण बफर में resuspend के लिए अपकेंद्रित्र
  7. 1.6 कदम दोहराएँ.
  8. या तो प्रोटीन के नमूने की एकाग्रता आकलन के साथ आगे बढ़ना या उन्हें -20 ° सी. पर दुकान

2. प्रोटीन एकाग्रता अनुमान

के बारे में 4.5 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 के लिए उद्देश्य, Lowry 7 परख या बीसीए 8 परख (पियर्स) का प्रयोग करें.

3. ध्यान केंद्रित Isoelectric

  1. एक ReadyStrip IPG पट्टी (11 सेमी, पीएच 5-8, जैव रेड) निकालें-20 डिग्री सेल्सियस और यह आरटी पर 10-15 मिनट के लिए संतुलित करना करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. प्रोटीन नमूना नमूना और विंदुक 6-800 (कुल मात्रा 200 μL) μg भंवर नमूना पुनर्जलीकरण ट्रे में एक चैनल के पीछे किनारे पर एक सीधी रेखा में, प्रत्येक के अंत में 1 सेमी के बारे में छोड़ने.
  3. संदंश का प्रयोग, IPG पट्टी की प्लास्टिक कवर बंद छील - केवल पट्टी के सिरों को संभालने के लिए और जेल के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए सुनिश्चित करें. नोट पट्टी के बुनियादी अंत और ट्रे के बाईं ओर पर स्थिति. नमूना के शीर्ष पर नीचे IPG जेल साइड पट्टी प्लेस, फँसाने बुलबुले से बचने के नीचे है. यह एक घंटे के लिए rehydrate के लिए अनुमति दें.
  4. 2.5 एमएल खनिज तेल (BioRad) के साथ ओवरले. ढक्कन के साथ ट्रे कवर, और कमरे के तापमान पर रातोंरात rehydrate छोड़.
  5. ध्यान केंद्रित ट्रे चैनल के दोनों सिरों पर एक कागज बाती प्लेस और 10 μL Millipore पानी के साथ हर एक गीला.
  6. पट्टी IPG बाहर ले जाओ और पकड़ के बारे में 10 सेकंड के लिए नाली तेल खड़ी. प्लास्टिक ख ब्लाटएक Kimwipe साथ acking.
  7. IPG पट्टी जेल पक्ष नीचे और छोड़ दिया करने के लिए बुनियादी अंत के साथ ध्यान केंद्रित ट्रे में रखें. 2.5 एमएल खनिज तेल के साथ पट्टी कवर.
  8. बहुरूपिया IEF सेल (जैव रेड) और 20 के डिफ़ॉल्ट सेल के तापमान पर एक 3 कदम प्रोटोकॉल (तालिका 1) प्रोग्राम में ट्रे प्लेस डिग्री सेल्सियस, 50 μA / पट्टी, और कोई पुनर्जलीकरण समय की एक अधिकतम वर्तमान.
    वोल्ट समय वाल्ट-बजे रैंप
    चरण 1 250 20 मिनट रैखिक
    चरण 2 8000 2.5 घंटा रैखिक
    चरण 3 8000 +४०,००० तीव्र
    कुल 6.5 घंटा +४०,०००

    तालिका 1. 11 सेमी IPG स्ट्रिप्स के लिए तीन कदम बहुरूपिया IEF सेल के प्रोटोकॉल.

  9. IEF संदंश का उपयोग सेल के IPG बाहर स्ट्रिप्स ले लो. Kimwipe के साथ प्लास्टिक समर्थन ब्लाट और IPG पट्टी जेल की ओर एक स्वच्छ पुनर्जलीकरण ट्रे में जगह. आप पुनर्जलीकरण ट्रे कवर और प्लास्टिक लपेटो और दुकान पर के साथ लपेट कर सकते हैं - 80 डिग्री सेल्सियस या आगे बढ़ना.

4. एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. एक 11 सेमी संतुलन ट्रे में स्थानांतरण पट्टी (जेल तरफ ऊपर).
  2. चैनल में कमी बफर (6 एम यूरिया, 2% एसडीएस, 0.05 एम / Tris एचसीएल 8.8 पीएच, 20% ग्लिसरॉल, 2% डीटीटी) की 4 एमएल जोड़ें और हल्के झटकों के साथ 10 मिनट के लिए पट्टी को संतुलित करना.
  3. कमी बफर निकालें, alkylation बफर (6 एम यूरिया, 2% एसडीएस, 0.05 एम / Tris एचसीएल 8.8 पीएच, 20% ग्लिसरॉल, 2.5% iodoacetamide) के 4 एमएल जोड़ें और हल्के झटकों के साथ 10 मिनट के लिए पट्टी को संतुलित करना.
  4. Stri सूई द्वारा IPG पट्टी कुल्लापी 1 एक्स एसडीएस चल बफर में संक्षिप्त (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस, पीएच 8.2).
  5. पट्टी जेल तरफ 11 सेमी की पीछे की थाली पर ऊपर लेटाओ मानदंड पूर्व डाली 10.5% -14 Tris - एचसीएल एसडीएस polyacrylamide जेल% (जैव रेड) और यह धीरे इतना है कि यह एसडीएस जेल के साथ पूर्ण संपर्क में आता है धक्का; सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले दो जेल सतहों के बीच फंस रहे हैं.
  6. पिघला हुआ agarose समाधान के 1 एमएल (0.5% agarose, 25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस, bromophenol नीले) के साथ IPG पट्टी ओवरले और agarose 5 मिनट के लिए जमना.
  7. आणविक भार मानकों के रूप में अच्छी तरह से एक में लोड: प्रोटीन मार्कर के 5 μL 10-225 केडीए (76,740 USB, पी / एन).
  8. एसडीएस बफर (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस, पीएच 8.2) में कमरे के तापमान पर 200 वी पर या एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) bromophenol नीले डाई सामने प्रवास का उपयोग करने के लिए वैद्युतकणसंचलन की निगरानी में जेल चलाएँ.
  9. जेल प्लास्टिक कलाकारों से निकालें और धीरे Coomassie खूब ब्लू में झटकों से रातोंरात दागआर-250 दाग (45.5% मेथनॉल, 45.5% dH2O, 9.0% एसिटिक एसिड, 0.25% Coomassie खूब ब्लू आर 250).
  10. Destain एक समाधान (45.5% मेथनॉल, 45.5% DH 2 हे, 9.0% एसिटिक एसिड) में दो बार जेल हिलाएँ 3 प्रत्येक और Destain 2 में (5% मेथनॉल, 90% DH 2 हे, 5% एसिटिक एसिड) रातोंरात घंटे के लिए . 7% एसिटिक एसिड में विश्लेषण के लिए जेल स्टोर.

5. जेल इमेजिंग और विश्लेषण

  1. मात्रा एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम है कि VersaDoc इमेजिंग प्रणाली (BioRad) संचालित का उपयोग जैल की छवियों पर कब्जा. छवि क्षेत्रों को समान रूप से अपने प्रयोग में सभी जैल के लिए फसल.
  2. PDQuest 8.0 सॉफ्टवेयर प्रोग्राम पर फसली छवियों को लोड करने के लिए एक प्रयोग सेट बनाने के लिए. हाजिर का पता लगाने और जैल भर मिलान हाजिर के लिए पैरामीटर को परिभाषित करने के लिए प्रयोग सेटअप विज़ार्ड का पालन करें. परिणाम मैन्युअल मिलान अगर जरूरत मौके का निरीक्षण करें और परिष्कृत करें.
  3. जैल के मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए tw के साथ मिलान प्रोटीन स्पॉट का पता लगाने के प्रदर्शनओ गुना या दो जेल समूहों के बीच उच्च सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति में मतभेद. ब्याज की इन धब्बों के साथ सेट विश्लेषण बनाएँ और उन्हें काट बाहर trypsin पाचन और LC-एमएस आधारित प्रोटीन की पहचान के लिए एक EXQuest हाजिर कटर (BioRad) का उपयोग कर.

6. में जेल tryptic पाचन

इस कदम एक संशोधित में जेल पियर्स Tryptic डाइजेस्ट किट (# 89871X, पियर्स) के लिए प्रोटोकॉल का प्रयोग किया जाता है.

  1. जेल प्लग destaining समाधान के 200 μL (25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, 50% acetonitrile) जोड़ें. भंवर और 37 पर नमूने सेते ° सी झटकों के साथ 30 मिनट के लिए. ध्यान हटायें और समाधान त्यागें.
  2. 6.1 कदम दोहराएँ.
  3. हौसले से तैयार कम करने के बफर (50 मिमी Tris [2 carboxyethyl] phosphine, 22.5 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट) 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जेल प्लग और सेते युक्त ट्यूबों के 30 μL जोड़ें
  4. नमूनों को शांत करने की अनुमति दें, तो हटाने और कम करने बफर त्यागें.
  5. Alkylation बफर (100 मिमी iodoacetamide, 20 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, पन्नी लिपटे ट्यूबों में उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार की 30 μL जोड़ें अंधेरे में नमूने 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. निकालें और alkylation बफर त्यागें. प्रत्येक ट्यूब के समाधान destaining के 200 μL जोड़कर जेल प्लग धो लें. 37 नमूनों में सेते ° C 15 मिनट के लिए.
  7. निकालें और destaining समाधान त्यागें और धोने दोहराने.
  8. जेल प्लग acetonitrile के 50 μL जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए उन्हें सूखी हटना करने के लिए अनुमति के लिए सेते हैं, तो ध्यान से acetonitrile हटायें.
  9. कदम 6.8 में एक बार और दोहराएँ. जेल टुकड़े सफेद और छोटे देखना चाहिए.
  10. जेल टुकड़ों को 10 मिनट के लिए एक Centrivap Concentrator (Labconco, EX1245 मॉडल) में शुष्क करने की अनुमति दें.
  11. सक्रिय trypsin समाधान (10 एनजी / μL trypsin, 25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट) के 10 μL जोड़कर जेल टुकड़े पक्की. 15 मीटर के लिए कमरे के तापमान पर सेतेinutes.
  12. ट्यूबों के लिए 25 μL पाचन बफर (25 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट) जोड़ें. झटकों के साथ रातोंरात कमरे के तापमान पर नमूनों को सेते हैं.
  13. 10 मिनट के लिए नमूने Sonicate (Branson, स्नान sonicator मॉडल 2510) और एक ताजा ट्यूब को सतह पर तैरनेवाला हटाने से पहले उन्हें नीचे स्पिन. सतह पर तैरनेवाला सहेजें.
  14. आगे पेप्टाइड्स निकालने के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% चींटी एसिड और सेते के झटकों के साथ 10 μL जोड़ें. 10 मिनट के लिए नमूने Sonicate, सतह पर तैरनेवाला जमा और 6.13 कदम में सहेजा सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन.

7. पेप्टाइड के अर्क के Microscale desalting

  1. PepClean सी-18 स्पिन (ThermoFisher) निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्तंभ की मदद के साथ पेप्टाइड के अर्क में अमोनियम बिकारबोनिट और अन्य लवण निकालें.
  2. Elute पेप्टाइड्स 20 μL 70% acetonitrile के साथ दो बार, Centrivap Concentrator में centrifugation द्वारा 1 घंटे और resuspend के लिए सूखी नमूने लुप्त हो जाना10 μL 0.1% एमएस विश्लेषण के लिए चींटी एसिड में पेप्टाइड्स.

8. HPLC युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन की पहचान

  1. मैं 40 मिनट पर एक उच्च प्रदर्शन तरल chromatograph (HPLC) की पेप्टाइड मिश्रण के अलग 5 μL, 0.2% चींटी एसिड के साथ एक Pepswift अखंड स्तंभ PS-DVB (Dionex) पर एक रेखीय 2-50% acetonitrile ढाल का उपयोग कर एक Nanospray के लिए युग्मित स्रोत पर नोक पर 400 nl / मिनट के प्रवाह की दर में एक आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर (LCQ Deca XP मैक्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक).
  2. 400 से बीच पेप्टाइड MS1 संकेतों का पता लगाने - 1400 m z / और 3 सबसे तीव्र आयन MS2 अनुक्रमण के लिए गतिशील अपवर्जन के साथ सीआईडी ​​द्वारा अलग किया जा चोटियों के लिए अनुमति देते हैं.
  3. प्रोटीन की पहचान के लिए एक स्थिर alkylated सिस्टीन संशोधन और phosphorylation के लिए गतिशील संशोधनों (सेरीन, threonine, tyrosine), methyla के साथ एक Sequest माउस संदर्भ डेटाबेस खोज (BioWorks सॉफ्टवेयर, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के माध्यम से पेप्टाइड परिणामों का विश्लेषण(हिस्टडीन) tion, ऑक्सीकरण (methionine), (arginine) ADP ribosylation, और एन टर्मिनल एसिटिलीकरण. रूढ़िवादी मिलान मापदंड (जैसे, पेप्टाइड 2 एएमयू और 1.00 टुकड़ा सहिष्णुता, प्रोटीन कम से कम 2 Xcorr बनाम प्रभार राज्य फिल्टर गुजर पेप्टाइड्स होते करने के लिए सेट सहिष्णुता लागू z = 1 / x = 1.5, z = / 2 x 2.00 = z = [ 3 / x = 2.50, z = 4 / x 3.00 =] और पी के एक प्रायिकता <) 0.05 5 और मैन्युअल विश्वास प्रोटीन की पहचान के लिए एमएस स्पेक्ट्रा का निरीक्षण किया.

9. प्रतिनिधि परिणाम:

नर और मादा करमुक्त murine कंकाल की मांसपेशी (मछलियां brachii) निकाला और एक दो आयामी 5 नक्शा, मांसपेशियों तुलनात्मक proteome (चित्रा 2) के पहले के स्तर में विभाजित किया गया था. एक बार उच्च संकल्प डिजिटल इमेजिंग का उपयोग कल्पना, के बारे में 800 प्रोटीन स्पॉट प्रत्येक में पाया गया. पुरुष proteome नक्शे का प्रयोग एक आधार रेखा के रूप में, यह स्पष्ट है कि वहाँ कई स्थानों है कि महिला proteome में बहुतायत में परिवर्तन कर रहे हैं. हाजिर तीव्रता हैं प्रोटीन की मात्रा में परिवर्तन के उपायों (चित्रा 3). कि दो गुना (ऊपर या नीचे) से अधिक परिवर्तन और प्रोटीन स्पॉट की पहचान सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) एक n = 5 चूहों के साथ, अमीनो एसिड अनुक्रम तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. इन परिणामों से पता चलता है कि महिलाओं चीनी ऊर्जा चयापचय एंजाइमों में और creatine kinase एंजाइम (सीके) isoforms, मांसपेशियों में एक अलग ऊर्जा की आपूर्ति प्रणाली में एक बहुतायत कमी का प्रदर्शन. दोनों मनुष्यों और पशुओं उच्च आराम और निम्नलिखित व्यायाम 9,10 पुरुष सीरम सी.के. स्तर प्रदर्शित करते हैं, लेकिन सीरम सी.के. स्तर जरूरी myofibrillar 11,12 व्यवधान की राशि के साथ सहसंबंधी नहीं करते. Murine मछलियां brachii मांसपेशियों में सी.के. के सेलुलर बहुतायत में यह लिंग द्विरूपता एक finding5 उपन्यास है और physiologically अलग सीरम सी.के. स्तर का जवाब हो सकता है.

आंकड़े:

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चित्रा 1 तुलनात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए प्रोटोकॉल का एक समग्र योजनाबद्ध. नमूना विश्लेषण; और प्रोटीन की पहचान नमूना तैयारी: प्रोटोकॉल को तीन समूहों में subdivided है. प्रोटोकॉल के इन तीन समूहों में से प्रत्येक के सिरों भी उचित रोक स्थानों, हालांकि सबसे अच्छा परिणाम अगर समग्र प्रोटोकॉल को रोकने के बिना बाहर किया जाता है हुई हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 महिला murine मछलियां brachii प्रोटीन की तुलना पुरुष मछलियां brachii में समान स्पॉट (हरी हलकों ओ) के सापेक्ष स्पॉट. स्पॉट है कि अधिक से अधिक या महिलाओं में दो गुना के बराबर वृद्धि हुई लाल (ओ) की परिक्रमा कर रहे हैं और उन है कि कम से कम या दो गुना के बराबर की कमी हुई नीले (ओ) की परिक्रमा कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 जेल स्पॉट तीव्रता विश्लेषण: X-अक्ष, महिला.(नियंत्रण, n = 5) पूर्व व्यायाम, Y-अक्ष, मुक्केबाज़ी महिला एकल 0 घंटा समय बिंदु समूह (n = 5). प्रतिगमन लाइन: सहसंबंध गुणांक = 0.919; ढलान = 0.976; = अवरोधन -0.०,२९३. दो गुना - लाल और नीले रंग की रेखा से नीचे रेखा से ऊपर स्पॉट / + से अधिक परिवर्तन.

Discussion

नियंत्रण रेखा / एमएस प्रोटिओमिक्स यहाँ प्रस्तुत विधि कंकाल की मांसपेशी proteome के पहले के स्तर की एक तेजी से विश्लेषण के लिए एक सबसे विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल है. यह लिंग विशिष्टता के एक यथोचित समीचीन तुलना के लिए अनुमति देता है. कम बहुतायत प्रोटीन मांसपेशियों के नमूने के एक fractionation के रूप में संभव के रूप में सिकुड़ा प्रोटीन के कई दूर करने के लिए, जिससे कम बहुतायत प्रोटीन में वृद्धि की आवश्यकता होगी. Proteome प्रोफ़ाइल सिलाई भिन्न पीएच रेंज IPG स्ट्रिप्स और वैकल्पिक प्रतिशत ढाल जैल के साथ पूरा किया जा सकता है अगर वांछित. अधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट दाग मौजूद हैं, लेकिन हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक प्रयोगशाला आपके सिस्टम में इन दाग के linearity निर्धारित है. प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक और अधिक कठोर विश्लेषण के लिए DIGE प्रणाली (दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में, जीई हेल्थकेयर लाइफ साइंसेज) में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस पद्धति के लिए जटिलता का एक स्तर जोड़ने करता है. इसके अलावा, इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल सबसे ani के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैमल ऊतकों जिसके लिए एक जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है, के रूप में डी किसी भी स्रोत से एक प्रोटीन की नोवो अनुक्रमण के रूप में अच्छी तरह से, के रूप में के रूप में लंबे समय से यह एक दो आयामी जेल पर हल किया जा सकता है, क्योंकि अतिव्यापी एंजाइमी टुकड़े इसके अलावा में उच्च शुद्धता एंजाइमों का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है trypsin करने के लिए. अन्य ऊतकों के स्रोतों से नमूने निष्कर्षण कार्यप्रणाली में कुछ परिवर्तन की आवश्यकता है, झिल्ली और hydrophobic प्रोटीन के लिए देख रहे हैं, खासकर यदि तथापि, हम अच्छे परिणाम हृदय, जिगर, गुर्दे, और मस्तिष्क के ऊतकों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है हो सकता है. अन्य बाद translational संशोधनों जन स्पेक्ट्रम डेटाबेस खोज मापदंड को संशोधित करके पता लगाया जा सकता है. संक्षेप में, हम एक हद तक विस्तृत विश्लेषण proteome रूपरेखा के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम चित्रा 3 का उपयोग करने के लिए Yutian गण मन धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 0420971 द्वारा समर्थित किया गया था, स्मिथ कॉलेज Blakeslee, Wilens और होम्स धन, और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PepClean C-18 Spin Columns Consumable Thermo Fisher Scientific, Inc. PI-89870
Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) Consumable Dionex 162348
Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels Consumable Bio-Rad 345-0106
Readystrip IPG strips Consumable Bio-Rad Varying pH ranges
Acetic acid Reagent Fisher Scientific A465-1
Acetone Reagent Pharmco Products, Inc. 329000
Acetonitrile Reagent Fisher Scientific A955
Agarose Reagent Bio-Rad 163-2111 Overlay
solution
Ammonium bicarbonate Reagent Fluka 40867
Bromophenol blue Reagent Fisher Scientific BP114
Bio-Lyte Ampholytes Reagent Bio-Rad Varying pH
ranges
CHAPS Reagent USB Corp., Affymetrix 13361
Commassie blue R-250 Reagent Thermo Fisher Scientific, Inc. 20278
Dithiothreitol (DTT) Reagent USB Corp., Affymetrix 15395
Formic acid Reagent Thermo Fisher Scientific, Inc. 28905
Glycerol Reagent Sigma-Aldrich G6279
Glycine Reagent USB Corp., Affymetrix 16407
Iodoacetamide Reagent Sigma-Aldrich I6125
Methanol Reagent Fisher Scientific A452
Mineral oil Reagent Bio-Rad 163-2129
Sodium dodecyl sulfate Reagent Sigma-Aldrich L6026
Tris base Reagent Sigma-Aldrich 93349
Tris[2-carb–xyethyl] phosphine Reagent Thermo Fisher Scientific, Inc. 77720
Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade Reagent Pierce, Thermo Scientific 90055 modified
Urea Reagent USB Corp., Affymetrix 75826
Water Reagent Burdick & Jackson 365
Centrivap Concentrator Tool Labconco Corp.
Exquest spot cutter Tool Bio-Rad
LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer Tool Thermo Fisher Scientific, Inc.
Motorized pestle Tool Kontes Corp
Polypropylene stirring Tool Biospec Products
rods
PROTEAN IEF cell Tool Bio-Rad
Sonicator Tool Branson
Surveyor Plus HPLC system Tool Thermo Fisher Scientific, Inc.
VersaDoc imaging system Tool Bio-Rad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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चिकित्सा 58 अंक कंकाल की मांसपेशी लिंग 2 - डी जेल वैद्युतकणसंचलन HPLC / एमएस माउस
प्रोटिओमिक्स से कंकाल की मांसपेशी लैंगिक द्विरूपता
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Dimova, K., Metskas, L. A., Kulp,… More

Dimova, K., Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics. J. Vis. Exp. (58), e3536, doi:10.3791/3536 (2011).

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