Summary
분리 및 골격 근육 표현이 가장 풍부한 단백질의 신원을 확인하는 방법을 똑바로 앞으로 설정할 수 있습니다. 약 800 곳 10 MG 근육에서 2 차원 겔에 분별되며 이것은 성별 특정 단백질 표현의 결정을 허용합니다. 이러한 방법은 대부분의 조직에 상응하는 결과를 제공합니다.
Abstract
골격 근육의 수축은 주로 총 수축성 단백질의 상대적으로 적은 수의에 의해 결정됩니다, 그러나이 조직은 또한 쓰지 않음으로 저항 운동과 위축에 의한 비대와 같은 환경 요인 1 현저하게 적응이다. 그것은 따라서 스트레스 (열, 국소 빈혈, 중금속 등.) 2,3로 리모델링하고 adaptations을 전시하고있다. , 소위 편심 수축 4 길어 동안 손상이 근육 exerting 강제로 근육에 발생할 수 있습니다. 수축성 단백질은 같은 exertions에 손상 타락한 및 / 또는 resynthesized, 수리해야 할 수 있으며 이러한 기능은 수축성 단백질의 일부가 아니지만, 세포의 다른 훨씬 더 풍부한 단백질. 차등을 결정하는 단백질의 하위 집합이 손상이 유형의 개량에 관련된 어떤 확인하려면, 글로벌 프로테옴은 5 운동하기 전에 설정해야 다음 운동 이후 다음단백질 표현함으로써 피해 및 복구 adaptations에 후보 단백질을 선택합니다. 또한, 골격근 대부분의 연구는 종족의 남성에서 실시되고 있으며 따라서 여성 근육의 대표되지 않을 수 있습니다.
이 문서에서 우리는 남성과 여성의 근육에서 단백질을 추출 reproducibly하고, 고해상도 디지털 이미징 6 다음 2 차원 겔 전기 영동하여 분리하는 방법을 제시. 이것은 표시 명소 (그리고 이후에 확인된 단백질)에 대한 프로토콜을 통계적으로 의미 (P <0.05) 두 배 증가 또는 감소가 나타나거나 제어 상태에서 사라집니다.을 제공합니다 이들은 다음 excised 트립신과 함께 소화와 단백질 식별 (LC / MS / MS) 5 질량 분석기 (LC / MS)로 결합 고압 액체 크로마 토그래피로 구분됩니다. 이 방법론 (그림 1) (간, 뇌, 소리없이 변경 거의 많은 조직에서 사용할 수 있습니다t 등.).
Protocol
1. 샘플 준비
- 자료를 시작으로 생쥐에서 신선한, 플래시 냉동 또는 RNAlater - 처리 조직을 사용합니다. 계속하기 전에 Kimwipe있는 모든 여분의 방부제 멀리 얼룩.
- 근육 주위 힘줄과 근막을 제거하고 조직이 잘 다진 혹은 가루 때까지 감기에 방 (4 ° C)에서 냉장 유리 접시에 2 분 하나의 에지 면도날로 조직을 말하다. 미리 무게 microfuge 튜브의 샘플을 수집하고 조직의 무게를 결정합니다. 를 시작 물질로 조직의 10 개 이상 MG를 사용합니다.
- 상온에서 1 MG 다진 조직 당 45 μL 추출 버퍼를 (8 M 요소, 50 MM DTT, 4 % 챕스, 0.2 % 캐리어 ampholytes 8분의 5, 0.0002 % bromophenol 블루) 추가합니다. 볼륨이 350 μL보다 큰 경우, 처음에 350 μL를 추가하고 (단계 1.4) homogenize 다음 splashing을 최소화하기 위해 버퍼의 나머지 부분을 추가합니다.
- 15초에 대한 조직에게 전동 유봉 (Kontes 사)로 일곱 번 Homogenize4 ° C, 2 분 각 균질 사이에 얼음 냉각과 함께.
- 4 30 분 15,600 XG에서 샘플을 원심 ° C. 뜨는을 저장하고 해당 볼륨을 측정합니다. 세포 파편 펠렛은 삭제됩니다.
- 얼음처럼 차가운 시약 - 등급 아세톤 (V 비율 3 회 V)와 함께 뜨는의 단백질을 침전. 15 초간 소용돌이 튜브. 알약을 형성하고, Kontes 모터와 폴리 프로필렌 교반 막대 (BioSpec는 생산성)을 추출 버퍼에 resuspend 10 초 동안 15600 XG를위한 원심 분리기
- 단계 1.6 반복합니다.
- 어느 시료의 단백질 농도 추정을 진행하거나 -20 ° C.에 그들을 저장
2. 단백질 농도 추정
4.5 MG ML -1을 목표로, 로리 분석 7 BCA 분석 8 (피어스)를 사용합니다.
3. 초점 Isoelectric
- ReadyStrip IPG 스트립 (11cm, 산도 5-8, 바이오 RAD)를 제거-20 ° C에서하고 10-15 분 RT에서 평형 수 있습니다.
- 소용돌이 샘플 rehydration 트레이에 채널의 뒤쪽 가장자리에서 직선으로 단백질 샘플의 샘플 및 피펫 600-800 μg (총 볼륨 200 μL), 각 끝 부분에 대한 1cm를 떠나.
- 집게를 사용하여 IPG 스트립의 플라스틱 커버 벗기다 - 스트립만을 종료를 처리하고 젤과의 접촉을 피하기 위해 있는지 확인하십시오. 스트립의 기본 끝을 참고 트레이의 왼쪽에서 위치를. 아래 샘플 위에 IPG 스트립 젤 - 측면을 놓고 트래핑 거품을 아래 마십시오. 그 한 시간 rehydrate 수 있습니다.
- 2.5 ML의 미네랄 오일 (BioRad)와 중첩. 뚜껑있는 트레이를 커버하고, 실온에서 하룻밤 rehydrate에 둡니다.
- 초점 트레이 채널의 양쪽 끝에 종이 심지를 장소와 10 μL Millipore의 물을 각각 젖었어.
- 스트립을 IPG 꺼내와 약 10 초 유출 기름 수직 만요. 플라스틱 B를 얼룩Kimwipe로 acking.
- 초점 트레이에 아래와 왼쪽에있는 기본 엔드와 IPG 스트립 겔 쪽 놓습니다. 2.5 ML의 광유와 스트립을 커버.
- 프로 테우스 IEF 셀 (바이오 - RAD) 및 프로그램 20 기본 셀 온도에서 3 단계 프로토콜 (표 1)에 트레이를 놓고 ° C, 50 μA / 스트립없이 rehydration 시간의 최대 전류.
전압 시간 볼트 - 시간 램프 1 단계 250 20 분 선형 2 단계 8000 2.5 시간 선형 3 단계 8000 40,000 빠른 합계 6.5 시간 40,000 표 1. 스트립을 IPG 11cm를위한 프로 테우스 IEF 세포의 3 단계는 프로토콜입니다.
- 집게를 사용하여 IEF 세포 밖으로 IPG 스트립을 가져가라. Kimwipe로 플라스틱 지원을 얼룩하고 깨끗한 rehydration 트레이에있는 IPG 스트립 겔 측면을 넣으십시오. 당신은 rehydration 트레이를 커버하고에서 플라스틱 포장 및 저장 그것을 포장을 할 수 - 80 ° C 또는 진행합니다.
4. SDS의 polyacrylamide 겔 전기 영동
- 11cm의 평균 트레이에 스트립 (겔 사이드까지)를 전송합니다.
- 채널 축소 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2퍼센트 DTT) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분에 대한 스트립을 평형.
- 감소 버퍼를 제거 알킬화 버퍼 (6 M 요소, 2% SDS, 0.05 M 트리스 / HCL 산도 8.8, 20 % 글리세롤, 2.5 % iodoacetamide) 4 ML을 추가하고 가벼운 흔들림과 함께 10 분 동안 스트립을 평형.
- 취소선을 찍기하여 IPG 스트립을 씻어1 X SDS 실행 버퍼에 P를 잠시 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2).
- 11cm의 뒤에 접시에 스트립 겔 측면을 배치 기준을 사전에 캐스트 10.5 % -14 트리스 - HCL SDS의 polyacrylamide 젤 % (생물 RAD)와 그것이 SDS 겔과 완전한 접촉을 만드는 정도 부드럽게 밀어; 방울이 두 겔 표면 사이에서 고민하지 있는지 확인하십시오.
- 용융 아가로 오스 솔루션 1 ML (0.5 % 아가로 오스, 25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, bromophenol 파란색)와 IPG 스트립을 중첩하고 아가로 오스 5 분 동안 응고하자.
- 분자량 표준으로 하나의 우물에 : 단백질 마커의 5 μL 10-225 kDa를 (76,740 USB, P / N)로드합니다.
- 상온에서 200 V 또는 전기를 모니터링하는 bromophenol 청색 색소 전면 마이 그 레이션을 사용하여 차가운 방 (4 ° C)에서 SDS 버퍼 (25 MM 트리스, 192 MM 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.2)에서 젤을 실행합니다.
- 플라스틱 캐스트에서 젤을 제거하고 Coomassie 브릴리언트 블루에 부드럽게 흔들어에서 하룻밤 얼룩R - 250 (45.5 % 메탄올, 45.5 % dH2O, 9.0 % 초산, 0.25 % Coomassie 브릴리언트 블루 R - 250) 얼룩.
- 삼시간 하룻밤 각각 Destain 2 (5 % 메탄올 90 % DH 2 O 5 % 초산)에 두 번 Destain 한 솔루션 (45.5 %의 메탄올, 45.5 % DH 2 O, 9.0 % 초산)에서 젤 흔들어. 분석을 위해 7% 초산에서 젤 저장합니다.
5. 젤 이미징 및 분석
- VersaDoc 이미징 시스템 (BioRad)을 운영하고 수량 하나의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 젤의 이미지를 캡처합니다. 실험의 모든 젤에 대해 균일하게 이미지 영역을 자르기.
- 실험 세트를 만들 수있는 PDQuest 8.0 소프트웨어 프로그램에 자른 이미지를로드합니다. 현장 감지 및 젤류 전체와 일치하는 지점에 대한 매개 변수를 정의하는 실험 설정 마법사를 따르십시오. 필요한 경우 수동으로 결과를 일치하는 지점을 검사하고 수정하십시오.
- TW와 일치하는 단백질의 명소를 검색하는 데 젤류의 양적 및 통계 분석을 수행두 겔 그룹 간의 표현 O 배 이상 통계적으로 의미있는 차이. 관심이 명소 설정된 분석을 만들고 트립신의 소화와 LC - MS - 기반 단백질 식별을위한 EXQuest 명소 커터 (BioRad)를 사용하여 잘라.
6. 인 겔 tryptic 소화
이 단계 수정된 피어스 인 겔 Tryptic 다이제스트 키트 (# 89871X, 피어스)에 대한 프로토콜이 사용됩니다.
- 겔 플러그에 destaining 용액 200 μL (25 MM의 탄산수 소 암모늄, 50 % acetonitrile)을 추가합니다. 와동 37에서 샘플을 품어 ° 잡고 30 분 C. 조심스럽게 솔루션을 제거하고 폐기.
- 6.1 단계를 반복합니다.
- 신선한 감소 버퍼 (50 MM 트리스 [2 - carboxyethyl] phosphine, 22.5 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 분 60 ° C에서 겔 플러그와 부화를 포함하는 튜브합니다. 30 μL를 추가
- 샘플 냉각 허용, 다음 제거하고 줄이고 버퍼를 폐기하십시오.
- 알킬화 버퍼 (호일 싼 튜브에 사용하기 전에 바로 준비 100 MM의 iodoacetamide, 20 MM의 탄산수 소 암모늄, 30 μL를 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 어둠의 샘플을 품어.
- 제거하고 알킬화 버퍼를 폐기하십시오. 각 튜브 솔루션을 destaining 200 μL를 추가하여 겔 플러그를 씻으십시오. 37 샘플을 품어 ° C를 15 분 동안.
- 제거하고 폐기 destaining 솔루션을하고 세차를 반복합니다.
- 겔 플러그에 acetonitrile 50 μL을 추가하고 그들이 건조 수축 수 있도록 실온에서 10 분 동안 그들을 품어 후 신중하게 acetonitrile를 제거합니다.
- 한번 더 단계 6.8를 반복합니다. 젤 조각은 흰색과 작은 보일 것입니다.
- 겔 조각이 10 분 Centrivap 농축기 (Labconco, 모델 EX1245)에 건조하도록 허용합니다.
- 활성화된 트립신 용액 (10 NG / μL 트립신, 25 MM의 탄산수 소 암모늄) 10 μL를 추가하여 겔 조각 그랬군요. 15m에 대한 상온에서 부화inutes.
- 튜브 25 μL 소화 버퍼 (25 MM의 탄산수 소 암모늄)을 추가합니다. 잡고 하룻밤 실온에서 샘플을 품어.
- 10 분 동안 샘플을 Sonicate (브랜슨, 목욕 sonicator 모델 2510)과 새로운 튜브에 뜨는를 제거하기 전에 그들을 아래로 스핀. 뜨는을 저장합니다.
- 추가 펩티드를 추출하려면, 잡고 상온에서 5 분 0.1 % 개미의 산 및 부화 10 μL를 추가합니다. 10 분 동안 샘플을 Sonicate 뜨는를 수집 단계에서 저장한 6.13 뜨는와 결합.
7. 펩타이드 추출물 Microscale 탈염
- 제조 업체 지침에 따라 PepClean C - 18 스핀 열 (ThermoFisher)의 도움으로 펩타이드 추출물에 탄산수 소 암모늄 및 기타 소금을 제거합니다.
- Elute 펩티드 두 번 20 μL 70 % acetonitrile과 함께 1 시간 resuspend에 대한 Centrivap 농축기에서 원심 분리하여 건조 샘플을 증발MS 분석 10 μL 0.1 %의 개미 산에있는 펩티드.
8. HPLC - 결합 질량 분석법에 의한 단백질 식별
- Pepswift 단일 PS - DVB 칼럼 (Dionex)에 0.2 % 개미의 산성과 함께 선형 20-50%의 acetonitrile 기울기를 사용하여 사십분 이상의 고성능 액체 크로마토 그래프 (HPLC)의 펩타이드 혼합물의 분리 5 μL는 Nanospray에 결합 I 끝에 400 NL / 분의 유량에서 이온 트랩 질량 분석기 (LCQ Deca XP 맥스, 써모 피셔 과학)에 소스.
- 1천4백미터 / Z과 역동적인 배제와 CID에 의해 MS2 시퀀싱을 위해 격리하는 3 가장 강렬한 이온 봉우리에 대한 허용 - 400 사이의 펩티드 MS1 신호를 감지합니다.
- 단백질 식별을 위해, 정적 alkylated 시스테인 변경 및 인산화에 대한 동적 수정 (세린, 트레오닌, 티로신), methyla와 Sequest 마우스 참조 데이터베이스 검색 (BioWorks 소프트웨어, 열 피셔 과학)를 통해 펩타이드 결과를 분석기 (히스티딘), 산화 (메티오닌), ADP - ribosylation (아르기닌) 및 N - 터미널 아세틸화. 보수와 일치하는 기준 (예 : 단백질이 Xcorr 대 충전 상태 필터를 통과 최소한 2 펩티드를 포함하는 2 AMU와 1.00 조각을 허용, 설정 펩타이드 공차를 적용합니다 [Z = 1 / X = 1.5, Z = 2 / X = 2.00, Z = 3 / X = 2.50, Z = 4 / X = 3.00]와 P의 확률 <0.05) 5 수동으로 자신감이 단백질 식별을위한 MS 스펙트럼을 검사합니다.
9. 대표 결과 :
남성과 여성 unexercised, murine 골격근은 (팔뚝의 brachii) 추출 및 2 차원지도 5, 근육 비교 프로테옴 (그림 2)의 첫 번째 수준으로 분리되었다. 일단 고해상도 디지털 이미징을 사용하여 시각, 약 800 단백질의 명소가 각 감지되었습니다. 남성 프로테옴지도를 사용하면 기준으로, 그것은 여성의 프로테옴에 풍부하게 변경하는 것이 많은 장소가있다는 것을 분명하다. 현지 농도입니다 단백질 금액의 변경 조치 (그림 3). 이상 (위 또는 아래) 두 배 이상의 변화와있는 단백질 명소의 신원은 통계적으로 의미 (P <0.05) N = 5 마우스와 액체 크로마 토그래피 - 결합 질량 분광법을 사용하여 아미노산 서열 분석에 의해 결정됩니다. 이러한 결과는 여성이 설탕의 에너지 대사 효소와 크레아틴 키나제 효소 (CK) isoforms, 근육에서 다른 에너지 공급 시스템에 풍부한 감소를 보여주는 것을 보여줍니다. 인간과 동물 모두 휴식과 다음 운동 9,10 높은 남성 혈청 CK 수준을 표시하지만, 혈청 CK 수치는 반드시 myofibrillar 장애 11,12의 크기는 서로 관련이 없어요. murine 팔뚝의 brachii 근육에서 CK의 세포 풍부하게이 성별 동종 이형는 소설 finding5이며 생리학 다른 혈청 CK 수준을 응답 수 있습니다.
인물 :
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그림 1. 비교 proteomics에 대한 프로토콜의 전체 개략도. , 샘플 분석 및, 단백질 식별 샘플 준비 : 프로토콜은 세 그룹으로 세분화됩니다. 전체 프로토콜 중단하지 않고 수행하는 경우 가장 좋은 결과를 얻고 있지만 프로토콜이 세 그룹의 각 엔드도 합리적인 정지 장소입니다.
그림 2. 여성 murine 팔뚝의 brachii 단백질의 비교는 남성 팔뚝의 brachii에서 동일한 반점 (녹색 원 O)에 상대적인 명소. 보다 크거나 여성의 두 배 증가와 같은 명소은 빨간색 (O)를 돌고 있으며보다 두 배 같다 감소 이들은 파란색 (O)를 돌고있다.
그림 3 젤 명소 강도 분석 :. X - 축, 암사전 운동 (제어, n은 = 5), Y 축, 0 인사 시점 그룹 한판 승부 여성 하나 (n은 = 5). 회귀 라인 : 상관 계수 = 0.919; 기울기 = 0.976; 가로채 = -0.0293. 두 배 - 붉은 선 위에있는 파란색 라인 아래의 명소는 + / 이상을 변경합니다.
Discussion
여기에 제시 LC / MS proteomics 방법은 골격 근육 프로테옴의 첫 번째 수준의 빠른 분석을 위해 가장 신뢰할 수 있고 재현성 프로토콜입니다. 그것은 성별 특이성의 합리적인 편법 비교 있습니다. 낮은 풍부 단백질은 근육 샘플 분획화가이를 낮은 풍부한 단백질을 증가, 가능한 한 수축성 단백질의 많은를 제거해야합니다. 원하는 경우 프로테옴 프로파일을 조정하는 것은 다양한 산도 범위 IPG의 스트립 및 대체 비율 기울기 젤과 함께 수행할 수 있습니다. 더 민감한 형광 얼룩이 존재하지만, 우리는 각 연구소가 시스템에서 이러한 얼룩의 선형을 결정하는 것이 좋습니다. 단백질 표현의보다 엄격한 분석을위한 DIGE 시스템 (2 차원 전기 시스템 - 젤에서 GE 헬스케어 생명 과학)를 사용할 수 있습니다 그러나 이것은 방법론에 복잡한 수준을 추가 않는다. 또한, 여기에서 설명하는 프로토콜은 대부분의 애니와 함께 사용할 수 있습니다중복 효소 조각이 이외에 고순도 효소를 사용하여 생성할 수 있습니다 년부터 게놈이뿐만 아니라 어떤 소스에서 단백질의 드 노보 시퀀싱으로 합성되어있는 말 조직은만큼 그것은 2 차원 겔에 해결할 수 있습니다 트립신 수 있습니다. 막과 소수성 단백질을 찾고, 그러나, 우리는 심장, 간, 신장 및 뇌 조직이 프로토콜을 사용하여 좋은 결과가 있었 특히 다른 조직 소스에서 샘플은 추출 방법의 일부 변경을 요구할 수 있습니다. 다른 포스트 translational 수정은 질량 스펙트럼 데이터베이스 검색 기준을 수정하여 감지 수 있습니다. 요컨대, 우리는 프로테옴 프로 파일링 분석을위한 합리적인 세부 초기 프로토콜을 제시했습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그림 3의 사용 Yutian Gan 주셔서 감사합니다. 스미스 대학 Blakeslee, Wilens 및 홈즈 자금,,이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 0,420,971에 의해 지원되었으며 하워드 휴즈 의학 연구소.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Consumable | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-89870 | |
| Pepswift monolithic column (100um x 5 cm) | Consumable | Dionex | 162348 | |
| Criterion pre-cast 10.5%-14% Tris-HCl SDS polyacrylamide gels | Consumable | Bio-Rad | 345-0106 | |
| Readystrip IPG strips | Consumable | Bio-Rad | Varying pH ranges | |
| Acetic acid | Reagent | Fisher Scientific | A465-1 | |
| Acetone | Reagent | Pharmco Products, Inc. | 329000 | |
| Acetonitrile | Reagent | Fisher Scientific | A955 | |
| Agarose | Reagent | Bio-Rad | 163-2111 | Overlay solution |
| Ammonium bicarbonate | Reagent | Fluka | 40867 | |
| Bromophenol blue | Reagent | Fisher Scientific | BP114 | |
| Bio-Lyte Ampholytes | Reagent | Bio-Rad | Varying pH ranges |
|
| CHAPS | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 13361 | |
| Commassie blue R-250 | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20278 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 15395 | |
| Formic acid | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28905 | |
| Glycerol | Reagent | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Glycine | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 16407 | |
| Iodoacetamide | Reagent | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Methanol | Reagent | Fisher Scientific | A452 | |
| Mineral oil | Reagent | Bio-Rad | 163-2129 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Tris base | Reagent | Sigma-Aldrich | 93349 | |
| Tris[2-carb–xyethyl] phosphine | Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 77720 | |
| Trypsin Endoproteinase, TPCK treated, MS grade | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 90055 | modified |
| Urea | Reagent | USB Corp., Affymetrix | 75826 | |
| Water | Reagent | Burdick & Jackson | 365 | |
| Centrivap Concentrator | Tool | Labconco Corp. | ||
| Exquest spot cutter | Tool | Bio-Rad | ||
| LCQ Deca XP Max ion trap mass spectrometer | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Motorized pestle | Tool | Kontes Corp | ||
| Polypropylene stirring | Tool | Biospec Products | ||
| rods | ||||
| PROTEAN IEF cell | Tool | Bio-Rad | ||
| Sonicator | Tool | Branson | ||
| Surveyor Plus HPLC system | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| VersaDoc imaging system | Tool | Bio-Rad |
References
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