Summary
胫神经横断模型骨骼肌萎缩是一种耐受性良好，验证和可重复的模型。中描述和演示C57Black6小鼠模型手术协议。
Abstract
胫神经横断模型在啮齿类动物中去神经引起的骨骼肌萎缩是一种耐受性良好，验证和可重复的模型。虽然最初的开发中广泛使用，由于其较大规模的大鼠，小鼠的胫神经，留下完好的坐骨神经腓神经和腓肠神经分支，从而保持足够大，它可以很容易被操纵，无论是挤压或横断他们的目标肌肉。因此，这种模式提供的优势诱导坐骨神经横断模型少的发病率和障碍比下地，还允许调查研究生理，细胞和分子生物学机制的调节肌肉萎缩的过程中，在遗传工程小鼠。胫神经建筑材料的腓肠肌，比目鱼肌和跖肌，所以它的横断允许失神经骨骼肌快肌II型纤维和/或慢肌型组成的研究，我纤维。在这里，我们展示了胫神经横断模型在C57Black6鼠标。我们评估腓肠肌的萎缩，作为一个有代表性的肌肉，在1，2，和4周后去神经通过测量肌肉重量和纤维类型特定的横截面面积，对石蜡包埋的组织切片进行免疫染色快肌的肌球蛋白。
Introduction
骨骼肌失神经支配，由于外伤性周围神经损伤，疾病或药物干预，肌肉自愿收缩功能在眼前亏的结果。伴随肌肉开始萎缩，这种萎缩是可逆的，如果及时，优质的神经支配发生1,2。在没有神经支配，肌纤维萎缩的进展，在肌肉与发生不可逆的生物变化肌肉纤维化及肌纤维死亡。在这里，我们展示了胫神经横断模型，模型引起的失神经支配骨骼肌萎缩和纤维化，在小鼠体内。这种模式使科学家研究背后体内肌肉萎缩，腓肠肌和比目鱼肌的生理，细胞和分子生物学机制。虽然历史上主要用于大鼠，更近的应用，让这个模型，基因敲除和转基因小鼠系专门调查，以评估它们的作用特定的蛋白质（S）的感应，开发和维护，或者决议，肌肉萎缩及纤维化体内的兴趣。
胫神经是一个混合的运动感觉的啮齿类动物的后肢，外周神经和是三个终端坐骨神经分支之一。胫神经横断denervates腓肠肌，比目鱼肌和跖肌（三个小深屈肌的脚，包括胫骨后肌，趾长屈肌和屈hallicus的长肌），是一个标准化和验证模型大鼠3,4 。序列的时间点，可以很容易地解剖腓肠肌和比目鱼肌交的胫骨神经切断术，评估肌肉组织学和肌纤维形态测量或闪存冻结肌肉RNA和蛋白质的，目的是研究提取固定和处理，例如，调节肌肉萎缩的细胞信号网络。遗传算法strocnemius肌肉的混合纤维型肌（I型和II型，虽然主要是II型）和比目鱼肌I型纤维组成的相当大的比例，从而提供了快速和慢速肌5,6评估。胫神经横断模型适用于研究失神经性肌肉萎缩的过程中，短期（日）7和长期（周月）4,8。
在坐骨神经横断模型（失神经性肌肉萎缩的第二个模型常用于啮齿动物），胫骨神经切断术诱导少在动物发病率，使其成为一个更具吸引力的模型。坐骨神经横断denervates腿部（膝盖以下）和脚的肌肉，损害动物的走动能力2，而胫神经横断离开坐骨神经腓神经和腓肠神经分支不变，从而保持他们的目标肌肉和感官领土的。鼠标是无法跖屈或脚倒置，但能够轻易走动，体重承担同样的两后肢，从而大大减少发病率的模型。步态分析研究，评估步行模式已在胫骨和坐骨神经损伤的大鼠进行胫骨受伤9,10证明足迹和负重保存较好。此外，在胫骨神经横断模型，腓总神经可以在稍后的时间点被动员，迟发神经再生和转移作为源的研究设计，如果需要3。相比之下，延迟神经再生坐骨神经横断模型需要使用的神经移植到坐骨神经赤字，模型的技术难度非常显着增加，并限制其使用，熟练的外科医生。
虽然胫神经横断模型Requires熟悉无菌手术技术在动物手术操作，无论是胫神经和支配小腿肌肉很容易访问和操纵识别，从而使个人谁是不是外科医生，或具有丰富的经验与动物外科手术，可以很容易地掌握这个模型。
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Protocol
使用这个模型之前，研究者必须接受手术动物从他们的机构的理事机构使用协议的批准。该模型是研究伦理委员会，汉密尔顿健康科学公司，麦克马斯特大学（AUP＃10-04-24）批准，并严格按照加拿大动物保护协会的建议进行。
1。鼠标准备
- 称量鼠标。异氟醚或5％，2％氟烷麻醉。应确保有足够的麻醉清除保护外科医生使用的电路。 2-3分钟后，动物的呼吸会减缓。确保眨眼反射消失，并在爪子捏叉空间，以确认手术麻醉（ 即通过鼠标无响应）。眼科润滑剂应用的眼球，在手术过程中防止角膜干燥。
- 剃须大腿外侧和臀部坐骨神经缺口膝盖和消毒proviodine。剃须将免费保持切口的头发的部位，以确保有足够的可视化手术野，以尽量减少干扰与神经剥离和横断。可以被识别，这是优越，后方股骨，坐骨切迹通过触诊。
2。手术过程
- 减少吸入异氟醚2％（1％氟烷），将鼠标放在其侧面（侧用于手术朝上），经营或解剖显微镜下。另外可以进行手术治疗与手术放大镜为成人（20-25克）鼠标自3.5X放大倍率是令人满意的。
- 戴上无菌手套。通过触诊识别坐骨切迹。使用手术刀，切割皮肤从坐骨切迹大腿外侧膝（约1厘米）。
- 轻轻涂抹皮肤。识别股二头肌，这是平坦的表面肌肉大腿外侧紧接下方的皮肤。用细剪刀，拆股二头肌沿着肌纤维，并举行公开的弹簧拉钩暴露坐骨神经及其分支。
- 确定坐骨神经紧接深至股二头肌。都可以识别通过其特性有光泽的白色，直径约0.8毫米。它运行从坐骨切迹到膝盖，分支到胫骨，腓骨和腓肠神经的胭窝上面的水平。
- 轻轻分开胫，腓神经和腓肠神经分支与超细钳和弹簧microdissecting的剪刀。胫神经是最大的分支，通常是中央的。重要的是不要的神经，而分离的树枝粉碎。控股超细镊子外adventicial层的神经，使神经松弛（不教），将避免神经损伤和牵拉损伤。
- 完整和持久denervati的，切开胫骨神经尽量远侧microdissecting剪刀，小心地避免腘血管。另外，对于暂时神经预期在2-4周内完整的神经再支配，可以简单地被粉碎的胫骨神经与超细钳为15秒，而不是横断。 （周围神经损伤后再生将reinnervate目标肌肉。）
- 是必需的，如果完全去神经的横断胫神经缝合结束股二头肌的前表面用5-0薇乔以10-0尼龙和重近似股二头肌，以防止异常神经支配腓肠肌和比目鱼肌。
- 关闭与正在运行的5-0薇乔缝合皮肤。
3。术后护理
- 关闭吸入麻醉剂，但维持氧气流量。管理buprinorphine（或代替）镇痛皮下注射。
- 没有鼠标转移到一个干净的笼从麻醉中醒来时，床上用品。请毯上一个笼子内，直接观察下，直到走动。
- 软底笼（线）的转让及房屋充足的软床上用品。
- 在每天检查执行肢体状况的发展褥疮的鞋跟溃疡或咀嚼的证据的外科伤以及脚。如proviodine外用抗生素或防腐剂，可管理的小问题。规定动物安乐死的终点指标是减肥，恶劣的自我护理的证据（竖起毛皮），弯腰驼背的姿势。此外，主要伤口的干扰或溃疡不愈合在1-2周内局部抗生素或出现有疼痛的动物应该被牺牲掉。
4。失神经支配腓肠肌和比目鱼肌收获
- 在手术后所需的时间点，权衡与CO 2过量的鼠标和牺牲。
- 剃须双方的内侧方面手术和对侧控制的腿和用酒精清洁。将鼠标操作或解剖显微镜下，或者使用手术观赏放大镜放大。
- 手术肢体的小腿内侧皮肤切开，用解剖刀从脚踝到膝关节和踝关节周围的圆周上。轻轻拉扯皮肤，肌肉和大腿近端向钳断。这暴露了所有的腿部肌肉。确定，这是从膝盖后方的腿的脚踝上，紧靠下面的皮肤的小腿肌肉的腓肠肌。识别远端插入股二头肌，腓肠肌近端上的内侧面的膝盖。股二头肌出现在其远端插入薄薄膜和覆盖在腓肠肌的最基端部。使用剪刀钝端剥离，轻轻地从气体中分离的远端插入股二头肌肌肉trocnemius。
- 在其远端插入到跟骨，腓肠肌逐渐变细到跟腱。确定白色和强壮有力的跟腱，这似乎。保持用钳子跟腱，照顾不持有或粉碎腓肠肌，把跟腱跟骨插入用剪刀。
- 仍持有肌腱，轻轻抬起腓肠肌（淡红色）关闭深比目鱼（更深的红色），从远端插入朝着它的起源在膝盖（比目鱼可以收获另发）。
- 解剖腓肠肌关闭腿，除以用剪刀从内侧和外侧的股骨chondyles的起源腓肠肌。很温柔的对肌肉的牵引促进这一进程。小心不要压碎肌肉。
- 比目鱼现在清晰可见，立刻根据网站的腓肠肌。电梯比目鱼其插入跟腱或其小腿后部igin。如果不经意间提出的腓肠肌，比目鱼轻轻分开，从收获的标本。 （淡红色）腓肠肌和比目鱼（暗红色）在收获的标本由于其颜色差异仍然很容易识别。
- 精密的规模分别称量肌肉。
- 垂直拆分肌肉，半金鱼草冷冻在液氮中（随后的蛋白质和/或RNA的提取），组织学（ 即形态学评估，免疫组化）的一半固定在10％福尔马林或异戊烷中冷冻固定用液氮冷却，然后随意。
- 重复上述步骤4.3上的控制，取消操作，一边收获控制腓肠肌和比目鱼肌。
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Representative Results
胫神经的横断denervates的小腿腓肠肌，比目鱼肌和跖肌。在这里，我们评估腓肠肌萎缩的发展，作为一个代表性的肌肉。从2-3个月大的程琳，程雪，闵连秋，中国保健CHINESE HEALTH CARE 2007年第12期C57black 6小鼠（杰克逊实验室），1，2，或4周神经腓肠肌收获。肌肉的重量逐渐减小（ 图1），II型快肌纤维（ 图2），随着时间的推移的横截面的面积。腓肠肌是混纤型肌（I型和II型），但去神经诱导从I型，II型纤维11的纤维型开关，其结果有足够数量的类型I纤维可能不使用测量的和强大的统计分析。
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图1。失神经腓肠肌演示逐步萎缩，程琳，程雪，闵连秋，中国保健CHINESE HEALTH CARE 2007年第12期C57black 6小鼠进行横断右胫神经。腓肠肌失神经支配（右）和对侧控制（左）收获1，2，或4周后后肢神经切断。腓肠肌进行称重，并失神经肌肉的重量表示为对侧的控制神经支配肌肉的比率。失神经诱导一个渐进的肌肉质量损失。
图2。失神经支配腓肠肌演示逐步减少肌纤维横截面面积（A）失神经支配和控制腓肠肌福尔马林固定，切割横截面MUSCLê中间部分免疫染色抗骨骼肌肌球蛋白，快肌亚型（MY-32，适马，1:500稀释），其次是生物素标记的二次抗体和streptavidin-HRP/DAB描述7。作为染液使用苏木精。快肌Ⅱ型肌纤维染色棕色和慢肌I型纤维染色浅紫色。使用ImageJ软件（贝塞斯达，NIH）所描述的7,12，测定该纤维的横截面面积（CSA）。快肌Ⅱ型肌纤维表现出逐步萎缩。太少I型纤维是本，腓肠肌肌允许统计上有效的评价纤维尺寸。 点击这里查看大组（n = 6 9只/组。最低200肌纤维测定每块肌肉的手术型的审稿人蒙蔽数据为+ / - SD比例尺等于100微米）平均。 弄清楚 。
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Discussion
去神经引起的骨骼肌萎缩胫神经横断模型大鼠模型是一种常用的和很好的验证。我们已经适应了这个模型在小鼠中的使用，这使得研究者利用遗传工程小鼠的存在，并在体内研究的过程中，肌肉萎缩，肌肉质量7,8的调节至关重要的蛋白质在没有。腓肠肌和比目鱼肌，神经在这个模型中，能够容易且迅速，解剖以最小的处理能力，从而提供优良的品质mRNA和蛋白用于后续的分子分析。同样，由于肌肉的大小，它们可以被分割，提供从相同的动物的组织伴随组织学和形态学分析。如果后肢功能评估是必需的，走的轨道分析可以连续地执行。脚蘸墨和鼠标通过外壳上有纸走到底部。打印的特点，能够可靠地计量，并打进表明神经肌肉障碍和步态妥协的程度，因为足迹特征反映了功能的肌肉群13,14。在大鼠13虽然最初的开发和验证，步行道分析也可以进行在老鼠15。
胫神经横断一般耐受性非常好老鼠。只有单一剂量的止痛药在术后即刻期间是必要的。通过使用适当的无菌技术，软组织感染是罕见的。虽然胫神经切断引起感觉异常，感觉对足底的脚方面，我们的的经验C57black6和基因敲除或转基因小鼠来自此线路上不倾向于自动毁伤。然而，必须每天检查小鼠的自动自残的迹象，鞋跟，以及褥疮护理端点点。虽然我们可以忽略不计的死亡率机智h的模型，我们发现必须安乐死，约2-5％的小鼠由于自我介导的损伤，或压力性溃疡发展，操作后肢。手术后使用柔软的被褥是至关重要的，以确保动物的舒适性和操作侧有助于预防压力性溃疡的发展。坐骨神经结扎的SNI结扎模型（其中，胫骨和腓总分支的坐骨神经结扎，，，但腓肠原封不动）以及作为神经性疼痛的模型16,17。因此，异常性疼痛和热痛觉过敏可能发生在我们的模型，以及在脚下，但我们还没有看到明显的疼痛行为的小鼠正常的日常活动，柔软的被褥。
只有一后肢的胫神经横切自小鼠重量承受几乎是同样的两个后肢上，从对侧未操作的肢体的肌肉组织，可以作为每只动物的内部控制在7-10。这不一定是在坐骨神经横断模型的情况下，更重要的步态异常可诱发对侧肢体肌肥大反应。在胫神经横断模型中，我们通常使用的腓肠肌和比目鱼肌未操作的肢体控制肌肉7,8。如果研究者选择使用单独的动物从中收获控制肌肉，然后假手术应该执行。假手术包括麻醉，分裂的皮肤暴露胫神经，但没有横断的管理。皮肤只会被关闭后神经暴露。
在一些周围神经横断模型，武侠从近端残端目标肌肉神经再支配污染计划去神经。在此模型中，固定的近端胫骨横断神经的浅面股二头肌肌肉的界面，抑制，从而关闭TS的武侠神经再支配。因此，它是在模型中的一个关键的和必不可少的步骤。聚散两依依的神经支配是罕见的在这个模型中。
同样，谨慎处理的神经在手术过程中是必不可少的。胫神经，腓腓总神经分支必须被轻轻分离胫骨横断之前，并没有挤压或拉伸的过程中。粗暴地对待这些神经会危及它们的功能，部分denervating其他后肢肌肉。如果发生这种情况，动物的步态差异的影响相比，这些小鼠接受唯一的胫神经切断，肌肉负荷变量可能会污染的实验结果。同样，护理失神经支配肌肉解剖时，必须采取。应处理肌肉，肌腱，并没有直接掌握，以避免暗恋神器，将影响组织学，肌纤维形态分析，可能是基因表达。
吨ypically采用这种模型小鼠20-24克（2-3个月），作为动物成熟和坐骨神经，胫骨神经足够的大小都可以很容易地处理。该手术可以进行更年轻，更小的动物，如果需要的话，但限制因素，这里将成为手术医生的实力。这可能是一个问题，如果调查研究失神经支配的肌肉卫星细胞的反应感兴趣。卫星细胞再生能力减弱的老年人相比，年轻，动物18，因此可能需要年轻的动物在实验设计中，经验不足的运营商提出的技术挑战。
胫神经横断模型可以适应从一个简单的模型去神经引起的肌肉萎缩，肌肉神经再支配延迟（> 4周），如果需要的话，如果手术经验丰富的运营商1,3。经过一段时间去神经指定投资可以再次手术estigator，鼠标和腓总神经的神经调动reinnervate失神经支配肌肉。确定胫骨横断神经断端，修剪，并在其末端动员和腓总神经显微修复的胫骨神经断端。腓神经将增长约1毫米/天的速度，胫神经残端reinnervate腓肠肌和比目鱼肌。胫神经横断模型坐骨神经横断模型神经移植是没有必要再支配过程中2，因为腓总神经的可用性提供了一个优势。然而，应该指出的是，神经reanastomoses需要有熟练技能和经验的操作人员的精度。
总之，在这里，我们展示了胫神经横断小鼠模型中，作为一个方便，功能强大，很好的验证和可重复的模型去神经引起的骨骼肌萎缩。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到CIHR神经肌肉研究合作伙伴（JNM - 90959;到JAEB）的补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 | |
References
- Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
- Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
- Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neuroscience. , 103-503 (2001).
- Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
- Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
- Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
- Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427 (2012).
- Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
- Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
- Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
- Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
- Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
- Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
- McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092 (2011).
- Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
- Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).
