Summary
Le modèle de la section du nerf tibial est un modèle bien toléré, validé et reproductible de l'atrophie du muscle squelettique. Le protocole chirurgical de modèle est décrit et démontré dans C57Black6 souris.
Abstract
Le modèle de la section du nerf tibial est un modèle bien toléré, validé et reproductible de dénervation induit une atrophie du muscle squelettique chez les rongeurs. Bien qu'à l'origine développé et largement utilisé chez le rat en raison de sa grande taille, le nerf tibial chez la souris est assez grand qu'il peut être facilement manipulé avec soit écraser ou transsection, laissant les branches du nerf péronier et sural du nerf sciatique intact et préservant ainsi leurs muscles cibles. Ainsi, ce modèle offre l'avantage d'induire moins de morbidité et empêchement de la marche que le modèle de section du nerf sciatique et permet également aux chercheurs d'étudier les mécanismes biologiques physiologiques, cellulaires et moléculaires qui régissent le processus d'atrophie musculaire chez les souris génétiquement modifiées. Le nerf tibial fournit les jumeaux, soléaire et des muscles plantaires, de sorte que son transsection permet l'étude du muscle squelettique dénervé composé de fibres à contraction rapide de type II et / ou le type de contraction lente Ifibres. Ici, nous démontrons le modèle de section du nerf tibial chez la souris C57Black6. Nous évaluons l'atrophie du muscle jumeau interne, comme un muscle représentant, à 1, 2 et 4 semaines après la dénervation par la mesure de poids de muscle et de type surface de la section de fibre spécifique sur paraffine coupes histologiques immunocolorées pour la myosine de contraction rapide.
Introduction
Dénervation du muscle squelettique en raison d'une blessure traumatique des nerfs périphériques, une maladie ou une intervention pharmacologique, entraîne la perte immédiate de la fonction contractile musculaire volontaire. Muscle commence de façon concomitante à l'atrophie et cette atrophie est réversible si opportun, réinnervation de bonne qualité se produit 1,2. En l'absence de réinnervation, myofiber atrophie progresse, et les changements biologiques irréversibles dans le muscle se produit pas avec la fibrose musculaire et la mort de fibres musculaires. Ici, nous démontrons le modèle du nerf tibial transsection, un modèle de dénervation induit une atrophie musculaire et la fibrose, chez la souris. Ce modèle permet aux scientifiques d'étudier les mécanismes biologiques physiologiques, cellulaires et moléculaires qui sous-tendent l'atrophie musculaire in vivo dans les muscles jumeaux et soléaire. Si, historiquement, utilisé principalement chez le rat, une application plus récente de ce modèle à élimination directe et les lignes de souris transgéniques en particulier, permet aux enquêteurs d'évaluer le rôle de leurnotamment les protéines (s) d'intérêt dans l'induction, le développement et la maintenance, ou encore la résolution de l'atrophie musculaire et la fibrose in vivo.
Le nerf tibial est un nerf périphérique moteur et sensoriel mixte dans la patte arrière des rongeurs, et est l'une des trois branches terminales du nerf sciatique. Résection du nerf tibial denervates les jumeaux, soléaire et les muscles plantaires (et les trois petits muscles fléchisseurs profonds du pied, y compris jambier postérieur, fléchisseurs des orteils et fléchisseur hallicus longus), et est un modèle bien normalisés et validés chez le rat 3,4 . Les muscles jumeaux et soléaire peuvent facilement être disséqués à des moments série poster section du nerf tibial, fixées et traitées pour l'évaluation de l'histologie des muscles et des fibres musculaires morphométriques, ou le flash gelé pour l'extraction de l'ARN du muscle et de protéines dans le but d'étudier, par exemple, les réseaux de signalisation cellulaires régulant l'atrophie musculaire. Le gastrocnemius muscle est un type musculaire de fibres mixtes (type I et de type II, bien que majoritairement de type II) et le muscle soléaire est composée d'une grande proportion de fibres de type I, fournissant ainsi les muscles à contraction rapide et lente à la fois pour l'évaluation de 5,6. Le modèle de la section du nerf tibial est adapté pour étudier le processus de dénervation induit une atrophie musculaire, tant à court terme (jours) 7 et à long terme (quelques semaines ou mois) 4,8.
Contrairement au modèle de section du nerf sciatique (un second modèle de dénervation induit une atrophie musculaire couramment utilisé chez les rongeurs), section du nerf tibial induit moins de morbidité chez l'animal, ce qui en fait un modèle plus attrayant. Résection du nerf sciatique denervates tous les muscles de la jambe (en dessous du genou) et le pied, ce qui nuit à la capacité de l'animal à déambuler 2, tandis que la section transversale du nerf tibial laisse les branches du nerf péronier et sural du nerf sciatique intact, préservant ainsileurs muscles cibles et les territoires sensoriels. La souris est incapable de flex plantaires ou inverser le pied, mais est capable de déambuler facilement et le poids porte également sur les deux membres postérieurs, ce qui diminue considérablement la morbidité du modèle. Études d'analyse évaluant la démarche habitudes de marche ont été réalisées chez le rat après les blessures de nerf tibial et sciatique et démontrer que l'encombrement et poids roulement est mieux préservée avec des blessures tibial 9,10. En outre, dans le modèle de section du nerf tibial, le nerf sciatique poplité externe peut être mobilisé à un moment ultérieur et transféré en tant que source de réinnervation retard, si la conception de l'étude nécessite 3. En revanche, réinnervation retard dans le modèle de section du nerf sciatique nécessite l'utilisation d'une greffe de nerf au déficit du nerf sciatique, très augmentant considérablement la difficulté technique du modèle et de limiter son utilisation aux chirurgiens qualifiés.
Alors que le nerf tibial modèle transsection récessite familiarité de l'opérateur avec la technique opératoire stérile dans la chirurgie des animaux, à la fois le nerf tibial et les muscles du mollet, il innerve sont facilement accessibles et identifiables pour la manipulation, de sorte que les personnes qui ne sont pas des chirurgiens, ou très expérimentés avec la chirurgie des animaux, peuvent facilement maîtriser ce modèle .
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Protocol
Avant d'utiliser ce modèle, les enquêteurs doivent avoir reçu l'approbation du protocole chirurgical de l'utilisation des animaux de leur institution organe. Le modèle est approuvé par le comité d'éthique de la recherche, Hamilton Health Sciences Corporation, l'Université McMaster (AUP # 10-04-24) et est effectuée en stricte conformité avec les recommandations du Conseil canadien de protection des animaux.
1. Préparation de la souris
- Peser la souris. Induire une anesthésie avec l'isoflurane 5% ou 2% d'halothane. Le circuit utilisé doit veiller à balayage adéquate de l'anesthésie pour protéger le chirurgien. Après 2-3 min de la respiration de l'animal va ralentir. S'assurer que le réflexe de clignement est absent et pincer les espaces interdigitaux dans la patte pour confirmer l'anesthésie chirurgicale (c'est à dire pas de réponse de la souris). Appliquer du lubrifiant ophtalmique à l'oeil, pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie.
- Rasez la cuisse et la fesse latérale de la sciatiqueentaille au genou et désinfecter avec proviodine. Rasage gardera le site de l'incision cheveux libre pour assurer une bonne visualisation du champ opératoire et pour minimiser les interférences avec dissection du nerf et transsection. L'échancrure sciatique, qui est supérieure et postérieure sur le fémur, peut être identifiée par la palpation.
2. Procédure d'Exploitation
- Réduire inhalation isoflurane à 2% (halothane 1%) et placez la souris sur le côté (côté destiné à la chirurgie vers le haut), en vertu d'un microscope opératoire ou dissection. Sinon chirurgie peut être réalisée avec loupes chirurgicales depuis grossissement 3.5X est satisfaisante pour un adulte (20-25 g) de la souris.
- Enfiler des gants stériles. Identifier l'échancrure sciatique par palpation. L'utilisation d'un bistouri, inciser la peau de la cuisse latérale de l'échancrure sciatique au genou (environ 1 cm).
- Doucement répandre la peau. Identifier le muscle biceps fémoral, qui est le muscle superficiel plat de la cuisse latéraleimmédiatement sous la peau. Avec des ciseaux fins, diviser le muscle biceps fémoral long des fibres musculaires et de tenir des consultations ouvertes avec un écarteur de printemps pour exposer le nerf sciatique et de ses branches.
- Identifier le nerf sciatique immédiatement profonde au muscle biceps fémoral. Il peut être identifié par sa couleur blanc brillant et caractéristique est d'environ 0,8 mm de diamètre. Il fonctionne à partir de l'échancrure sciatique au genou, se ramifiant dans les nerfs du tibia, du péroné et saphène au niveau du creux poplité.
- Séparez délicatement le tibial des branches du nerf saphène péronier et ultrafines avec une pince et des ciseaux microdissecting de printemps. Le nerf tibial est la plus grande branche et est généralement central. Il est important de ne pas écraser le nerf tout en séparant les branches. Tenir le nerf juste sur la couche adventicial externe avec la pince ultrafines, et de garder la tension de nerf (pas enseigné), permettra d'éviter écrasement du nerf et des blessures de traction.
- Pour denervati complète et durablesur, couper le nerf tibial avec microdissecting ciseaux distale que possible, en évitant soigneusement les vaisseaux poplités. Sinon, pour la dénervation temporaire avec réinnervation complète attendue dans 2-4 semaines, le nerf tibial peut simplement être écrasé avec une pince ultrafines de 15 sec au lieu de sectionné. (Nerfs périphériques repoussent après une blessure et seront Reinnervate muscle cible.)
- Si dénervation complète est nécessaire, suturer l'extrémité du nerf tibial sectionné à la surface antérieure du muscle biceps fémoral avec 10-0 Nylon et re-approximative du biceps fémoral avec 5-0 Vicryl pour empêcher aberrante réinnervation des gastrocnémiens et muscles soléaire.
- Fermer la peau avec une course de 5-0 suture Vicryl.
3. Les soins post-opératoire
- Éteignez l'anesthésique par inhalation, mais de maintenir le débit d'oxygène. Administrer buprinorphine (ou substitut) analgésique sous-cutanée.
- Transférer la souris dans une cage propre, sansliterie en se réveillant de l'anesthésie. Continuez à une couverture chauffante à l'intérieur de la cage et sous observation directe jusqu'à ambulante.
- Transfert et maison dans la cage de fond mou (non conducteurs) avec un grand matelas mou.
- Inspectez la branche opérationnelle quotidienne pour état de la plaie chirurgicale et le pied pour le développement d'ulcères de décubitus du talon ou des preuves de la mastication. Les problèmes mineurs peuvent être gérés avec des antibiotiques topiques ou des antiseptiques tels que proviodine. indicateurs Endpoint nécessitant l'euthanasie des animaux sont la perte de poids, la preuve d'une mauvaise prise en charge autonome (fourrure ébouriffée), et une posture voûtée. En outre, les animaux avec perturbation majeure des plaies ou des ulcères qui ne guérissent pas dans 1-2 semaines avec des antibiotiques topiques ou semblent avoir la douleur doivent être sacrifiés.
4. Gastrocnemius Dénervés et récolte de muscle soléaire
- Au point de temps post-opératoire souhaité, peser la souris et le sacrifice de CO 2 overdose.
- Raser la face médiale à la fois duopératoire et les jambes de contrôle controlatéral et propre avec de l'alcool. Placez la souris sous un microscope opératoire ou dissection, ou utiliser alternativement loupes de visualisation chirurgicales pour l'agrandissement.
- Sur la branche opérationnelle, inciser la peau du mollet avec un scalpel de la cheville vers le genou et la circonférence autour de la cheville. Tirez doucement sur la peau avec une pince hors du muscle et proximale vers la cuisse. Cette situation expose tous les muscles de la jambe. Identifier le muscle jumeau, qui est le muscle du mollet qui va du genou à la cheville sur la face postérieure de la jambe et se trouve immédiatement sous la peau. Identifier l'insertion distale du muscle biceps fémoral, proximale du muscle jumeau interne sur la face interne du genou. Lors de son insertion distale du biceps fémoral semble mince et vaporeuse et recouvre la partie la plus proximale du jumeau. Avec des ciseaux et l'extrémité émoussée dissection, séparer délicatement l'insertion distale du biceps fémoral du gazmuscle trocnemius.
- Lors de son insertion distale dans le calcanéum, le muscle gastrocnémien se rétrécit dans le tendon d'Achille. Identifier le tendon d'Achille, qui apparaît en blanc et nerveux. Tenez le tendon d'Achille avec une pince, en prenant soin de ne pas détenir ou écraser le muscle jumeau, et diviser le tendon d'Achille de l'insertion du calcanéum l'aide de ciseaux.
- Tout en maintenant le tendon, soulevez doucement le muscle jumeau (rouge pâle) hors du soléaire profondes (plus rouge), de l'insertion distale vers son origine au niveau du genou (le soléaire peuvent être récoltées séparément).
- Disséquer les jumeaux au large de la jambe en divisant l'origine des jumeaux des chondyles du fémur médial et latéral à l'aide de ciseaux. Traction très doux sur le muscle facilite ce processus. Veillez à ne pas écraser le muscle.
- Les soléaire seront désormais clairement visible, immédiatement sous le site des jumeaux. Soulevez le muscle soléaire de son insertion sur le tendon d'Achille de son ouIgin sur le mollet postérieur. Si le soléaire est relevé par inadvertance avec les jumeaux, séparer délicatement de l'échantillon récolté. Le jumeau (lumière rouge) et soléaire (rouge foncé) restent facilement identifiables dans l'échantillon récolté en raison de leurs différences de couleur.
- Peser séparément les muscles sur une balance de précision.
- Fractionner les muscles verticalement, la moitié de la congélation par encliquetage dans l'azote liquide (par la suite protéine et / ou l'extraction d'ARN), et l'autre moitié pour l'histologie (évaluation morphométrique, immunohistologie) de fixation soit en formol à 10%, ou la fixation congelés dans de l'isopentane refroidi par de l'azote liquide, , si besoin.
- Répétez l'étape 4.3 ci-dessus sur le contrôle, non exploité, côté à récolter jumeau de contrôle et les muscles soléaire.
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Representative Results
Section du nerf tibial denervates les jumeaux, soléaire et des muscles plantaires du mollet. Ici, nous évaluons le développement de l'atrophie du muscle jumeau interne, comme un muscle représentant. Muscle gastrocnémien ont été récoltés dans 2-3 mois vieux C57Black 6 souris (Jackson Laboratories) dénervées pour 1, 2 ou 4 semaines. poids musculaires diminuent progressivement (figure 1), comme le fait la section de fibres de type II à contraction rapide du muscle (figure 2), au fil du temps. Le jumeau est un type musculaire de fibres mixtes (type I et type II), mais dénervation induit un commutateur de type I à fibres de type II 11 de type fibre, et en raison d'un nombre suffisant de fibres de type I peut ne pas être disponible pour la mesure et analyse statistique robuste.
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Figure 1. Muscle jumeau dénervé montre une atrophie progressive. C57Black 6 souris ont subi une résection du nerf tibial droit. Muscle gastrocnémien a été récolté à partir de la commande dénervé (à droite) et controlatérale (gauche) hindlimbs à 1, 2 ou 4 semaines après la section du nerf. Muscles jumeaux ont été pesés, et le poids du muscle dénervé est exprimé sous forme de ratio du muscle innervé de contrôle controlatéral. Dénervation induit une perte progressive de la masse musculaire.
Figure 2. Muscle jumeau dénervé démontre diminution progressive des fibres musculaires zone de coupe (A) Dénervés et le contrôle muscles jumeaux étaient fixés au formol, les couper en section transversale à la MUSCLe mi-section et immunocolorées pour la myosine musculaire anti-squelettique, fast twitch isoforme (Ma-32, Sigma, dilution 1:500), suivie par l'anticorps secondaire biotinylé et streptavidin-HRP/DAB comme décrit 7. Hématoxyline a été utilisé comme contre. Fibres de type II à contraction rapide tache type de contraction brun et lent fibres-je teindre violet clair. La section transversale (CSA) des fibres a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ (Bethesda, NIH) comme décrit 7,12. Les fibres de type II à contraction rapide montrent une atrophie progressive. Trop peu de fibres de type I sont présents dans jumeau dénervées pour permettre une évaluation statistiquement valide de la taille des fibres. (N = 6 à 9 souris / groupe Un minimum de 200 fibres musculaires ont été mesurés par muscle par un évaluateur aveugle au phénotype opératoire données sont présentées sous forme de moyenne + / -... Bar SD échelle équivaut à 100 um). Cliquez ici pour agrandir comprendre .
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Discussion
Le modèle de la section du nerf tibial de la dénervation induit une atrophie du muscle squelettique est un modèle couramment utilisé et bien validé chez le rat. Nous avons adapté ce modèle pour une utilisation chez la souris, ce qui permet à l'enquêteur de tirer profit de l'existence de souris génétiquement modifiées et d'étudier le processus d'atrophie musculaire in vivo en l'absence de protéines essentielles à la régulation de la masse musculaire 7,8. Les muscles jumeaux et soléaire, les deux dénervé dans ce modèle, peuvent être facilement et rapidement disséqué avec un minimum de manipulation, il offre une excellente qualité d'ARNm et de protéines pour les analyses moléculaires ultérieures. De même, en raison de la taille des muscles, ils peuvent être divisés, en fournissant des tissus provenant du même animal pour des analyses histologiques et morphométriques concomitants. Si l'évaluation fonctionnelle du membre postérieur est nécessaire, la marche analyse de piste peut être réalisée en série. Les pieds sont trempés dans l'encre et la souris est parcouru par une enceinte de papier sur leinférieure. Caractéristiques des tirages peuvent être mesurés de façon fiable et marqués pour indiquer le degré d'invalidité neuromusculaire et de compromis de la démarche, puisque les caractéristiques de l'empreinte reflètent les groupes musculaires fonctionnelles 13,14. Alors qu'à l'origine développé et validé chez le rat 13, marche analyse de piste peut également être réalisée chez la souris 15.
Section du nerf tibial est généralement très bien tolérée par les souris. Une seule dose d'analgésique est nécessaire dans la période postopératoire immédiate. Avec l'utilisation d'une technique stérile appropriée, infection des tissus mous est rare. Alors que section du nerf tibial fait induire paresthésie sensorielle sur la face plantaire du pied, dans notre expérience C57black6 et KO ou souris transgéniques issus de cette ligne n'ont pas tendance à l'auto-mutiler. Cependant, les souris doivent être inspectés quotidiennement pour des signes d'auto-mutilation, les ulcères de pression sur le talon, ainsi que le point de critères d'évaluation des soins. Bien que nous ayons l'esprit de mortalité négligeableh le modèle, nous constatons qu'environ 2-5% des souris doit être euthanasié en raison d'une blessure auto-médiation, ou les ulcères de pression sur le développement, le membre postérieur opéré. L'utilisation d'un matelas mou est en post-opératoire cruciale pour assurer le confort de l'animal et aide à prévenir la formation d'ulcères de pression sur le côté opéré. Ligature du nerf sciatique ainsi que le modèle SNI de la ligature (où les branches du tibia péroné et communes de la sciatique sont ligués, mais la saphène est laissée intacte) sont des modèles de douleur neuropathique 16,17. Ainsi, l'allodynie et l'hyperalgésie thermique pourrait se produire dans le pied de notre modèle ainsi, mais nous n'avons pas vu le comportement de la douleur manifeste chez les souris ayant une activité quotidienne normale sur un matelas mou.
Le nerf tibial d'un seul membre postérieur est sectionné et que le poids des souris portent presque égale sur les deux membres postérieurs, la musculature de la jambe non-opérée controlatéral peut être utilisé comme un contrôle interne au sein de chaque animal 7-10.Ce n'est pas nécessairement le cas dans le modèle de transsection sciatique, où des anomalies les plus significatifs de la démarche peuvent induire une réponse hypertrophique du muscle membre controlatéral. Dans le modèle de section du nerf tibial, nous utilisons généralement le muscle gastrocnémien et soléaire de la jambe non-opérée que notre muscle témoin 7,8. Si l'enquêteur choisit d'utiliser des animaux distincts à partir de laquelle la récolte muscle de commande, puis une intervention chirurgicale fictive doit être effectuée. Sham chirurgie serait composé de l'administration de l'anesthésie, le fractionnement de la peau pour exposer le nerf tibial, mais aucune résection. Peau serait tout simplement fermé l'exposition du nerf suivant.
Dans certains modèles transsection des nerfs périphériques, réinnervation errant du moignon proximal du muscle cible contamine la dénervation prévue. Dans ce modèle, la fixation de l'extrémité proximale du nerf tibial sectionné à la surface superficielle du muscle biceps fémoral, fermant ainsi l'interface de muscle, inhibiteursts de la réinnervation errant. En tant que tel, il est une étape cruciale et essentielle dans le modèle. Réinnervation Errant est rare dans ce modèle.
De même, une manipulation prudente du nerf pendant l'intervention chirurgicale est indispensable. Les branches du nerf saphène péronier et doivent être séparées doucement du nerf tibial avant résection tibiale, et non pas écrasés ou étirés dans le processus. Une manipulation brutale de ces nerfs se compromettre leur fonction, partiellement denervating autres muscles du membre postérieur. Si cela se produit, la démarche de l'animal sera influencé différemment par rapport à ceux des souris subissant une seule section du nerf tibial et le chargement du muscle variable peut contaminer les résultats expérimentaux. De même, des précautions doivent être prises lors de la dissection de la musculature dénervé. Muscle doit être manipulé par le tendon, et non directement saisissable pour éviter écrasement artefact qui aura une incidence sur l'histologie, musculaires analyses morphométriques de fibres et peut-être l'expression des gènes.
Nous Tabituellement employer ce modèle chez la souris 20-24 g (2-3 mois), que l'animal est arrivé à maturité et les nerfs sciatiques et tibial sont tous les deux d'une taille suffisante pour être facilement manipulé. La chirurgie peut être réalisée sur les jeunes, petits animaux, si désiré, mais le facteur limitant sera ici la prouesse du chirurgien. Cela peut être un problème si le chercheur s'intéresse à l'étude de la réponse des cellules satellites du muscle dénervé. Le potentiel de régénération des cellules satellites diminue de plus, comparativement aux jeunes, aux animaux 18 et par conséquent, les jeunes animaux peuvent être nécessaires à la conception expérimentale, en présentant un défi technique pour un opérateur moins expérimenté.
Le modèle de la section du nerf tibial peut être adapté à tout simplement un modèle de l'atrophie musculaire induite par la dénervation, l'un des réinnervation musculaire retardée (> 4 semaines), si désiré et si les opérateurs chirurgicaux expérimentés sont disponibles 1,3. Après une période de dénervation spécifié par l'investigator, la souris peut être réopéré et le nerf fibulaire mobilisée pour Reinnervate la musculature dénervé. Le moignon distal du nerf tibial sectionné est identifié, paré et le nerf sciatique poplité externe est mobilisé à son extrémité distale et microchirurgicalement réparé sur le moignon du nerf tibial. Le nerf sciatique poplité externe va croître à un rythme d'environ 1 mm / jour dans le moignon du nerf tibial à Reinnervate les muscles jumeaux et soléaire. Le modèle de la section du nerf tibial donne un avantage sur le modèle de la section du nerf sciatique chez qui une greffe de nerf n'est pas nécessaire dans la procédure de réinnervation 2 en raison de la disponibilité du nerf sciatique poplité externe. Cependant, il faut noter que reanastomoses nerveuses exige la précision d'un opérateur qualifié et expérimenté.
En résumé, nous démontrons ici le modèle de section du nerf tibial chez la souris, comme un modèle simple, robuste, bien validé et reproductible de dénervation induit une atrophie du muscle squelettique.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt sont déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du Partenariat de recherche neuromusculaire IRSC (JNM - 90959, à JAEB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| 10-0 Nylon suture | Ethicon | 2850G | |
| 5-0 Vicryl suture | Ethicon | J553G | |
| Equipment | |||
| Spring microdissecting scissors | Fine Surgical Tools | 15021-15 | |
| Ultra fine forceps | Fine Surgical Tools | 11370-40 | |
| Non locking micro needle holder (driver) | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Spring retractor | Fine Surgical Tools | 17000-02 | |
References
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