Summary
Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.
Abstract
İzole mitokondri Respirometrik profilleme yaygın elektron taşıma zinciri fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Bu, hücre dışı bir akım (XF) analiz cihazı kullanılarak, insan vastus lateralis örnekleri elde iskelet kas dokusunda en az miktarlardan mitokondri izole edilmesi için bir yöntem ve plaka bazlı respirometrik profil açıklanmaktadır. 1.0, 2.5 ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak elde edilen Respirometrik profillerin karşılaştırılması 1.0 ug solunum ölçmek için yeterli olduğunu göstermektedir ve 5.0 mikrogram standart hataların karşılaştırılması dayalı en tutarlı sonuçlar sağlar. Mitokondriyal işaretleyici COX IV olmayan mitokondriyal doku belirteci GAPDH için izole mitokondri, Western blot analizi, bu protokol kullanılarak sınırlı olmayan mitokondriyal kirlenme olduğunu gösterir. kas dokusunun az 20 mg gibi mitokondriyal Solunum çalışma yeteneği, kullanıcıların, klinik birden çalışmanın tamamlanması için bireysel biyopsi kullanmasına olanak sağlararaştırma projeleri.
Introduction
Mitokondri hücrenin birincil enerji üretim alanları ve yaşlanma önemli roller yanı sıra, kalp damar hastalıkları, Alzheimer hastalığı, diyabet, kanser ve aşırı şişmanlık gibi çeşitli yaş ile ilişkili bozukluklar vardır. İzole mitokondri Respirometrik profil elektron taşıma zinciri (OGS) fonksiyonu doğrudan analiz sağlar ve mitokondriyal biyoloji anlayışımız ve sağlık ve hastalık rolüne önemli katkılarda bulunmuştur. İzole mitokondri Bu yazıda anlatılan metodoloji insan denekler elde edilen iskelet kas dokusu biyopsi izole mitokondri Respirometrik analiz izin için optimize edilmiştir vb substrat ulaşım, ATP sentaz aktivitesi, proton sızıntısı, gibi biyoenerjitiklerin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılır. Bu yazıda anlatılan biyopsi protokol son 12 yıldır bizim personel tarafından kullanılmıştır. Grubumuz, çeşitli yaş yetişkin 700'den fazla prosedürleri yürüttü90 yaşına kadar, ve herhangi bir olumsuz güvenlik sorunları olmaksızın çeşitli kronik hastalık koşulları ile. Bu protokolün önemli bir yönü, özellikle böylece klinik araştırmalarda kullanımını kolaylaştıran, doku az miktarda kullanmak için tasarlanmış olmasıdır.
Çeşitli protokoller mitokondri izole edilmesi için geliştirilmiştir. Fernandez-Vizarra ve ark., 1,2 çeşitli fare dokuları gibi kültürlenmiş hücrelerden mitokondri izole etmek için bir yöntem açıklamıştır. Garcia-Cazarin ve ark. 3, sıçan ve fare iskelet kaslarının mitokondri izole etmek için bir yöntem bildirmiştir. Fare beyninden alınan mitokondri izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, aynı zamanda Iglesias-Gonzales ve ark. 4 Gross tarafından rapor edilmiştir, ve ark. 5 barocycler ve / veya PCT parçalayıcı kullanarak mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor etmiştir. Son zamanlarda, Franco ve ark. 6 anti kullanarak zenginleştirilmiş mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor-TOM22 Manyetik boncukları.
Bu protokoller mükemmel sonuçlar elde ederken, doku boyut gereksinimleri Bu yazıda anlatılan yönteme kıyasla yüksek. Örneğin, Gross vd. 5 gastrokinemius kası 1.5-1.8 g ve böbrek dokusu yaklaşık 2 g kullanılır. Benzer şekilde, Franco ve ark. 6 500 mg fare karaciğer dokusu kullanılır. Bizim deneyim, tipik verimleri iskelet kası (vastus lateralis) perkütan iğne biyopsisi beklenen 100-200 mg arasında değişir. Burada anlatılan protokol kullanılarak kas dokusunun 20-50 mg mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneği, diğer moleküler biyoloji deneylerinde gelecekteki kullanım için biyopsi başına ve mağaza örnekleri birden değerlendirmeler yapmalarına izin verir. Bu klinik araştırma ve örneklerin çalışkan kullanımını gerektiren diğer çalışmalarda kritik bir özelliktir. Daha önce dondurulmuş mitokondri oute bağlanmış solunum nedeniyle çalışmak için iyi olmadığını belirtmek gerekirmitokondriyal membran hasarına ve Sitokrom C aktivitesi kaybının r. Bizim yöntemi adapte Chappell ve Perry 7 tarafından yayınlanan yöntemle modifiye edilmiştir.
Bu yazıda anlatılan yöntemleri kullanarak, son zamanlarda insan vastus izole mitokondri Respirometrik profil doğrudan yürüyüş hızı 8 olarak ölçülen fiziksel yeteneği ile ilişkilidir lateralis olduğunu bildirmiştir.
Protocol
NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi.
1. İskelet Kası Biyopsi
- Daha önce açıklandığı gibi, 9 bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin.
NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi. - NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom 10 o uyarlanmıştır.
- Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin.
- Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al.
- Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal "pop" veya direnç izleyin.
- , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance.
- Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın.
NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer. - 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın.
- Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın.
- , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek.
NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg.
2. Mitokondriyal İzolasyon
<ol>3. Yıkama Mitokondri
- 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin.
NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir. - CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin.
NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir.
4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik
Rogers, GW ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 5. XF tahlilleri yapın. 12
NOT: pmole O 2 / dk O 2 tüketimi oranını (OCR) gözünüzde canlandırın, ya da veri çıkışı O 2 ve pH mutlak seviyeleri.
- Bileşikleri hazırlamak için 1x MAS kullanarak enjekte edilecek. Aşağıdaki gibi, bir son konsantrasyon elde etmek üzere bağlantı noktaları MS bileşiklerin 10x konsantrasyon ekleyin: Noktası A ADP [Adenozin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; B portu, oligomycin (2 uM, 55 ul); Port C, FCCP [karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon, 6 uM, 60 ul]; ve liman D, 2 mcM antimycin-A (65 ul). Hazırlamakkuyu sayısı için bileşiklerin yeterli bir miktar.
- Titrasyonuyla mitokondri optimum miktarda belirleyin. Örneğin, yük 1.0 ug, 2.5 ug, ve alt tabaka ihtiva eden buzla soğutulmuş 1x MAS bir 50 ul hacim içinde oyuk başına mitokondri 5.0 ug. İlk soğuk 1x MAS + substrat 10x mitokondri sulandırmak, kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için. Sonraki, (arka plan düzeltme kuyuları hariç) her bir kuyunun bu süspansiyon 50 ul teslim.
- 2000 x g'de, 4 ° C'de 20 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Her bir oyuğa (bakınız aşağıda başlangıç koşullarına) Santrifüj işleminden sonra, yavaşça 1 x MAS + süksinat (10 mM) ve rotenone (2 uM) 450 ul ilave edin. XF analizörü plaka transfer iyi önce homojen yapışmasını sağlamak için mikroskop altında mitokondri görüntüle.
Not: solunum ya da VB kompleksi I ya da kompleks II kaynaklı olup olmadığının bağlıdır kullanılan başlangıç koşullarını oluşturmuştur. Karmaşık II-odaklı solunum için, SU kullanınccinate (10 mM) ve başlangıç koşulları olarak rotenon (2 uM). Rotenone blokları kompleks I ve II süksinat kompleksi (süksinat dehidrogenaz) için yakıt sağlar. Kompleks I tarafından tahrik edilen solunum çalışma yapmak için, ilk koşullar olarak 10 mM'lik bir son konsantrasyonda 5 mM veya glutamat ve malat, her bir son konsantrasyonda piruvat ve malat, her birini kullanabilirsiniz. İkincisi trikarboksilik asit döngüsü ve yüzey ulaşım arasındaki disfonksiyon ayırt yardımcı olabilir. Hem kompleks I ve II kompleksi tarafından tahrik solunum çalışma başlangıç koşulları olarak rotenone veya malat olmadan piruvat ve süksinat dahil etmek. Β-oksidasyonu için bir alt-tabaka olarak palmitoil karnitin kullanın. - Sırayla önce 12 açıklandığı gibi programlayarak solunumu kullanarak gerçek zamanlı olarak mitokondriyal solunum ölçmek. Tablo 2'de verilmiştir respirometredeki ayarlarını kullanın.
NOT: aşağıdaki gibi çeşitli mitokondriyal solunum devletlerin kısa bir açıklama vardır:
6. Western Blot
NOT: Son örnek mitokondri zenginleştirme sağlamak için Western blot ile mitokondriyal işaretleyici COX IV ve tüm doku GAPDH belirleyin
- % 12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelleri izole edilmiş mitokondri ve bütün doku özü ayırın.
- Poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.
- COX IV antikoru (1: 20,000) ile inkübe yaban turpu peroksidaz (HRP), ve ardından ikincil antikorlar ile konjüge edilmiş. GAPDH tespiti için, bir GAPDH monoklonal antikor (: 2,000 1) ile leke ve prob şerit.
NOT: ER kontaminasyon farklılıklar endişe ise, böyle bir analiz ERp72, calnexin, ya kalretikulin olarak ER işaretçileri bulunur.
Representative Results
Şekil 1, tüm protokol ayrıntılı akış şemasını göstermektedir.
COX IV / GAPDH (Şekil 2), Western blot profilleri mitokondriyal protein COX IV olmayan mitokondriyal marker, GAPDH ekspresyonu tasvir etmektedir. COX IV ve GAPDH hem ifadesi, tüm kas hücresi içerisinde belirgindir. Mitokondri, bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak izole sonra GAPDH aynı pozlama de yokken, COX IV bantları hala belirgindir. Uzun poz bir soluk GAPDH bandı ortaya çıkarabilir. Bu lekeler izole mitokondri az olmayan mitokondriyal kontaminasyonu sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, izole edilmiş bir mitokondri COX IV ekspresyonu örnekler arasında tutarlıdır.
Şekil 3 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak kompleks II (süksinat ve rotenone) tarafından tahrik tipik Respirometrik profillerini göstermektedir. Beklendiği gibi, genel olarak, OCR ağırlık arttırılıri mitokondri yüksek miktarlarda. Bu deney için hesaplanan solunum kontrol oranı (RCR) mitokondriyal hazırlık kaliteli olduğunu belirten, 7.95. Ayrıca, devlet 3u OCR mitokondriyal kalitesini onaylayan, devletin 3 biraz daha yüksektir.
Mitokondri farklı miktarlarda profil oluşturma sırasında sonuç tutarlılığı karşılaştırma amacıyla, ANOVA (Varyans Analizi) oluşturulmuş ve kullanılarak varyans gerçek değerleri olarak kareler (SS) toplamı hesaplanır 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug başına yüklenmiştir iyi (Şekil 4). SS devlet 2, devlet 3, devlet 3U, Antimisin ve RCR sunulmuştur. Devlet 2 ve devlet 3 ölçümler için, tek yönlü ANOVA (sırasıyla, p <0.01 ve p <0.05) istatistiksel olarak anlamlı idi. Benzer şekilde, tek yönlü ANOVA antimycin ve RCR (p <0.01 ve p <0.0001 istatistiksel olarak anlamlı idi, sırasıyla. Anlamlı fark gruplar arasında devlet 3U görüldü. These sonuçlar kuyu başına mitokondri 5,0 mikrogram diğer konsantrasyonlara göre düşük SS verdi ve katılımcıların bizim nüfusa sahip XF 24 sistemde kullanılacak optimum miktarda olduğunu göstermektedir.
Şekil 5 çok mitokondriyal protein ilk kas örneklem büyüklüğü dayalı beklenebilir nasıl göstermek için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Beklendiği gibi işlenmiş kas (mg) miktarı ve son numune toplam mitokondriyal protein içeriği (mg) arasında güçlü bir ilişki vardır.
| Chappel-Perry tampon I (TÜFE) | |||
| Kimyasal | Konsantrasyon | ||
| KCI | 100 mM | ||
| MOPS | 50 mM | ||
| EDTA | 1 mM | ||
| MgSO 4 | 5 mM | ||
| ATP | 1 mM | pH | 7.4 |
| Chappel-Perry tampon II (CPII) | |||
| Kimyasal | Konsantrasyon | ||
| KCI | 100 mM | ||
| MOPS | 50 mM | ||
| EDTA | 1 mM | ||
| MgSO 4 | 5 mM | ||
| ATP | 0.2 mM | ||
| Yağ-asidi serbest BSA | 0.50% | ||
| pH | 7.4 | ||
| Mitokondriyal Deneyi Çözüm (MAS) (2X) | |||
| Kimyasal | Konsantrasyon | ||
| Sakaroz | 35 mM | ||
| Mannitol | 110 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 2.5 mM | ||
| MgCI2 | 2.5 mM | ||
| HEPES | 1.0 mM | ||
| EGTA | 0.5mM | ||
| Yağ-asidi serbest BSA | % 0.10 | ||
| pH | 7.4 | ||
| Karmaşık II başlangıç koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) | |||
| Kimyasal | Konsantrasyon | ||
| 1X MAS | |||
| Suksinat | 10 mM | ||
| Rotenone | 2 uM | ||
| pH | 7.4 | ||
| Karmaşık Ben başlangıç koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) | |||
| Kimyasal | Konsantrasyon | ||
| 1X MAS | |||
| Piruvat | 5 mM | ||
| Malat | 5 mM | ||
| pH | 7.4 | ||
| * Tüm tamponlar deiyonize su içinde yapılacak | |||
Tablo 1. Çözüm ve tampon tarifleri.
| Protokol Adımları | ||
| StartProtocol | ||
| Komuta | Zaman (dk) | Liman |
| Ayarlamak | 0.00 | |
| Bekleyin | 10.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Bekleyin | 3.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Bekleyin | 3.00 | |
| Karıştırmak | 0.50 | |
| Tedbir | 3.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Tedbir | 3.00 | |
| Karıştırmak | 0.50 | |
| Enjekte etmek | Bir | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Tedbir | 6.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Enjekte etmek | B | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Tedbir | 3.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Enjekte etmek | C | |
| Karıştırmak | 1.00 | > |
| Tedbir | 3.00 | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Enjekte etmek | D | |
| Karıştırmak | 1.00 | |
| Tedbir | 3.00 | |
| EndProtocol | ||
Tablo 2. Mix, ölçmek ve respirometredeki için çevrim ayarını karıştırın.
Şekil tüm protokol 1. Akış Şeması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. bütün iskelet kası dokusu hem de izole mitokondri için temsili bir Western blot. Tüm doku ekstraktı olarak izole mitokondri olmayan mitokondriyal kontrol mitokondriyal işareti ve GAPDH antikor gibi COX IV antikoru ile bağışık edilmiştir. Hiçbir GAPDH bandı olmayan mitokondriyal kaynaklardan az veya hiç bulaşmayı gösteren izole mitokondri gözlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İnsan Vastus izole mitokondri Şekil 3. Temsilcisi Respirometrik profil lateralis. Izole mitokondri üç konsantrasyonları, 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug biz Bu tahlilde kullanılan re. Liman enjeksiyondan sonra bileşiklerin Final konsantrasyonları 2 mM ADP (port A) idi; 2 mcM oligomycin (B portu); 6 mcM FCCP (port C); ve 2 mcM A (port D) antimycin. Bu çalışma için hesaplanan RCR 7.95 oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug mitokondri kullanarak farklı mitokondriyal solunum devletler ve RCR için kareler Şekil 4. karelerinin toplamı. Toplamı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ig5highres.jpg "/>
. Şekil 5. Bu ilk kas numune ağırlığı Regresyon analizine dayalı beklenebilir mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek için bir rehber olarak kullanılabilir: kas (mg) ve toplam mitokondriyal protein verimi (mg) miktarı. Beklendiği gibi, kas miktarı ve elde edilen toplam mitokondriyal protein arasında doğrudan bir korelasyon vardır.
Discussion
İzole edilmiş alt-tabaka, genellikle mitokondri taşıma ve TCA döngüsü fonksiyonu dahil olmak üzere VB fonksiyonunun rolü, hem de diğer mitokondri aktivitelerini incelemek çalışmalarda kullanılmıştır. Izole organelleri kullanarak Respirometrik testler oksidatif fosforilasyon temel süreçleri ve ETC içsel özelliklerinin doğrudan incelenmesine olanak Bütün hücrelerin veya permeabilize kas liflerine kıyasla izole edilmiş bir mitokondri respirometrik profili nispeten kolay veri yorumlama avantajları ve mitokondriyal kütle / biogenesizdeki olmayan mitokondriyal işlemler veya değişiklikleri "girişim" yokluğunu sahiptir. Verilerin Normalleştirme böylece numuneler arasında mitokondri basit çapraz karşılaştırma sağlayan, mitokondriyal protein içeriği dayanmaktadır. İzole mitokondri Respirometrik profil çalışmanın amacı altta yatan mekanizmalar ve ETC bileşeni olarak belirli hedefler belirlenmesi belirlemek için bir tercih yaklaşıms / kompleksler, ya da mitokondriyal taşıma mekanizmaları.
Küçük doku örneklerinden kas biyopsisi ve fonksiyonel mitokondri izolasyonu için protokol açıklanmıştır. El dounce homojenizatörlerinin işletilen karşı bu yöntem nedeniyle otomatik homojenleştirici kullanımına kullanıcıları arasında tekrarlanabilir sonuçlar verir. Mitokondri izolasyonu kas dokusu olarak yaklaşık 20 mg ile yapılabilir. Bu örnek büyüklüğü elde edilebilir izole mitokondri miktarı daha da moleküler analiz için başka deneyler ve depolama için fazla mitokondri bırakarak Hippocampus plaka bazlı Solunum çalıştırmak için yeterli değildir. Bu yöntem, mitokondri daha küçük miktarlarda (her 1-2 ug) kullanılabilir XF 96, tercüme edilebilir belirtmek gerekir.
Izole mitokondri için çeşitli protokoller ilk doku bozulması için dounce homojenizatör güveniyor. Bu yöntemin bir dezavantajı, eller, ilk doku doğası olanHomojenizasyon. homojenleştiricide tokmak ve kuvvet ve hız operatörleri 6 arasında önemli ölçüde değişebilir. Bu deney,-için-deney varyasyonu, hem de laboratuvar kadar laboratuarda değişmesine yol ve deneyler arasında veri karşılaştırması yapılmasını zorlaştırır olabilir. Katılımcılardan gelen veriler genellikle tedavi öncesi ve sonrası, ve potansiyel birden fazla site için ayrı zaman noktalarında toplanan bu insan müdahalesi çalışmalarında özellikle endişe vericidir. Biz sınırlı kişiden kişiye değişkenlik daha tekrarlanabilir sonuçlar verir daha tutarlı bir yaklaşım için bir otomatik homojenleştirici kullanın. hazırlama hızı, aynı zamanda, aynı anda birden fazla numune işleme için uygun olan, bu yaklaşım sağlar. Tipik olarak, en fazla üç deney, bir günde gerçekleştirilir.
Burada tarif edilen tekniğin potansiyel sınırlamaları izole organel kullanımı ve bir plaka temelli bir biçimde kullanımı ortaya çıkar. Örneğin, Picard et al. iblis varİzole mitokondri permeabilize myofibers bozulmamış mitokondri bu temelde farklı fonksiyonel özelliklere sahip olduğu strated. Onlar mitokondriyal izolasyon teknikleri gibi daha reaktif oksijen türlerinin üretimi 13 eşliğinde permeabilize myofibers göre önemli ölçüde artmıştır RCR olarak değişmiş bioenergetic fonksiyonu, neden önerdi. Permeabilize kas lifleri ile karşılaştırıldığında, mitokondri izolasyonu uzun hazırlık süresi gerektirir. Ayrıca, hücresel içeriği kaybı fizyolojik alaka, bütün hücreler ve hatta permeabilize lifleri tutulur bir şey azalır. açıklanan teknik izni ile plaka bazlı Respirometrik kullanımı örnek başına çalışır çoğaltmak. Ancak, mitokondri de her alt uymalıdır. Bu konfigürasyon, normal ortamından farklıdır ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir. Buna ek olarak, belirtilmelidir ki, mitokondriyal izolasyonu için protokol kullanılarak, TherE hala mitokondriyal hazırlık endoplazmik retikulum (ER) kirlenme olabilir. ER kirlenme farklılıklar mitokondriyal verim ve etkisi sonuçlarının belirlenmesini etkileyebilir.
Sonuç olarak, bu çalışma, bu prosedür kullanılarak dokulardan izole mitokondri işlevsel olarak aktif olan ve çalışmalar / iskelet kası numunelerin minimum miktarda yüksek kaliteli izole mitokondri gerektiren uygulamalar için kullanılabileceğini teyit etmektedir verileri sunulur. Bu yöntemin avantajı şudur: i) bir iskelet kası az miktarlardaki mitokondri izole edilmesi mümkündür, ii) işlem iii) plaka bazlı teknoloji, aynı zamanda birçok örnek arasında çalıştırmak mümkündür, hızlı ve iv) örnek depolama ve diğer moleküler biyolojik araştırmalar için bioenergetic tahlil sonra yeterli artı dokusu ve izole mitokondri vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | ||
| Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | ||
| 6 mm University College Hospital Needle | Cadence | ||
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | ||
| 96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | ||
| Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | ||
| Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | ||
| Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | ||
| Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | ||
| Consumables | |||
| XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 | |
| 100867-100 | |||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 | |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 | |
| ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 | |
| Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 | |
| Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 | |
| BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 | |
| Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 | |
| Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 | |
| Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 | |
| ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 | |
| XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 | |
| Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 | |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX | |
| Immobilin Transfer Membranes (0.45 um) | Millipore | IPVH20200 | |
| MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 | |
| Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 | |
| Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 | |
| Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA | |
| Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA | |
| *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |
References
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
- Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
- Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).
- Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).
