Summary
本プロトコルは、修正されたノータッチ技術を使用してウサギに動静脈瘻を作成することを提案しています。この技術は、静脈周囲組織の解剖または動脈の切断なしに、総頸動脈および外頸静脈の左右の吻合を含む。
Abstract
傍吻合狭窄症は、しばしば非成熟を引き起こし、動静脈瘻(AVF)の開存性を低下させる困難な問題です。手術中の静脈および動脈の損傷および血行動態変化は、内膜過形成を引き起こし、傍吻合狭窄症を引き起こす可能性がある。手術中の静脈と動脈の損傷を減らすために、この研究は、傍吻合狭窄の速度を減らし、AVF開存性を改善することができるAVF構築のための新しい修正ノータッチ技術(MNTT)を提案します。MNTTの血行動態変化とメカニズムを解明するために、この研究ではこの技術を使用したAVF手順を提示しました。この手順は技術的に困難ですが、適切なトレーニングの後、94.4%の手続き上の成功が達成されました。最終的に、34匹のウサギのうち13匹が手術後4週間で機能性AVFを示し、AVF開存率は38.2%でした。しかし、4週目の生存率は86.1%でした。超音波検査はAVF吻合による活発な血流を示した。さらに、吻合近傍の静脈と動脈にらせん状の層流が観察され、この手法がAVFの血行動態を改善する可能性があることが示唆されました。組織学的観察ではAVF吻合部で有意な静脈内膜過形成を認めたが,吻合近位外頸静脈(EJV)に有意な内膜過形成を認めなかった.この技術は、AVF構築のためのMNTTの使用の根底にあるメカニズムの理解を深め、AVF構築における外科的アプローチのさらなる最適化のための技術サポートを提供します。
Introduction
動静脈瘻(AVF)の構築は、維持血液透析(MHD)を受けている患者の臨床診療で広く使用されており、動静脈グラフト(AVG)またはトンネルカフカテーテル(TCC)よりも開存性が高く、合併症が少ない1,2。AVFは血管アクセスの好ましいモードですが、完全ではなく、固有の制限があります。1年間の一次AVF開存率はわずか60%〜65%であり、吻合部に近い領域で多くの障害が発生します3,4,5。
血管は、従来の外科的アプローチ中にさまざまな程度の損傷を受け、最終的にはAVFの成熟に影響を与えます。Hörer et al.6が提案したノータッチ法(NTT)(補足図1)やSadaghianlooらが提案した橈骨動脈エクスカーションおよび再移植(RADAR)などの新しい手術法は、手術手技を変更することで傍吻合狭窄率を低下させ、瘻孔開存性を改善するように設計されました。レーダーの効果はNTTよりも優れていたが、レーダーでは流入動脈狭窄がより顕著であることが認められた。手術中の静脈と動脈の損傷をさらに減らすために、2021年に、橈骨動脈を切断せずに橈側皮静脈周囲の静脈周囲組織を保存することにより、放射性頭蓋AVFを作成する新しい修正ノータッチ技術(MNTT)が提案されました(補足図1および補足図 2)。予備的な結果は、一次開存性の増加、傍吻合狭窄の減少、および動脈狭窄がないことを示しました10,11。
MNTTを用いたAVFの動物モデルが現在不足していることを考慮し、AVF手術におけるMNTTのメカニズムをさらに探求するために、本研究ではMNTTを用いた総頸動脈(CCA)-外頸静脈(EJV)AVF手順を導入する。
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Protocol
実験動物を用いた実験手順は、南京医科大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。この研究には、生後10か月のニュージーランドのウサギ(男女とも、体重3.18 ± 0.24 kg)が使用されました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.動物の準備
- 塩酸チレタミンと塩酸ゾラゼパム(3 mg / kg)の混合静脈内注射を辺縁耳静脈に、スミアンキシンII(0.02 mL / kg)の筋肉内注射を使用してウサギを麻酔します( 材料の表を参照)後肢の筋肉。.
注:約1〜3分後、麻酔効果は安定します。先に進む前に、首の後ろの皮膚をつまんで角膜反射を観察することによって麻酔のレベルをチェックする必要があります。必要に応じて、塩酸チレタミン、塩酸ゾラゼパム(0.5 mg / kg)、およびスミアンキシンII(0.01 mL / kg)を手術中に追加できます。. - ウサギを仰臥位で固定テーブル( 資料表を参照)の上に置き、手足と切歯をバインドで結びます。
- 電気カミソリを使用して首と胸の上部を剃り、動物用脱毛クリームで脱毛します( 資料表を参照)。
- 手術器具をオートクレーブし、ポビドンヨード溶液で手術部位を洗浄することにより、手術中の無菌状態を維持します。
2.皮膚切開
- ウサギの頭を外科医に向けて配置します。
- 外科用ハサミまたはメスの刃を使用して、下顎骨と胸鎖関節の間の縦方向の切開を~3cm行います。
3.外頸静脈(EJV)の準備
- 切開部を露出させ、右EJVを特定します。EJVとその血管周囲組織がはっきりと見え、解剖されていないことを確認してください。
注:EJVは逆「Y」パターンを示しており、内側頸部に近い枝を吻合する必要があります。 - EJVに垂直な方向に沿って血管クランプを通過できるトンネルを作成します( 材料の表を参照)。トンネルの両側の開口部とEJVの間の距離が>1cmであることを確認します。
- トンネルに沿って血管クランプを配置します。
- 同じ方法を使用して、遠位 EJV に別のトンネル (手順 3.2 と同じ) を作成します。
メモ: 2 つのトンネル間の距離が ≥2 cm であることを確認します。 - トンネルに沿って4-0縫合糸( 材料の表を参照)と血管クランプを適用して、血流を制御します(図1A)。
4.総頸動脈(CCA)の解剖と準備
- 鉗子( 資料表を参照)を使用して、気管の外側と胸鎖乳突筋の内側のCCAを探索します。
注意: CCAは拍動感覚を持ち、頸神経と平行に走ります。 - CCAを約2 cmの長さに鈍く解剖します。
注:深い動脈コースで迷走神経とその枝の損傷を避けてください。 - CCAの周りに4-0縫合糸を配置して、必要に応じて血流を制御します。
- 血管クランプ( 材料の表を参照)を可能な限り遠位および近位に適用します(図1B)。
5.吻合の準備
- 瀉血と吻合術の場合は、マイクロハサミ( 材料表を参照)を使用して、EJVの内部(長さ4 mm)を周囲の組織から解放して解剖します。
- 静脈の中央にマイクロハサミで長さ4 mmの縦切開を行います。血栓症を防ぐためにヘパリン溶液(100 IU / mL)で静脈をすすぎます。.
- 鋭利な刃とマイクロハサミを使用して、動脈の前壁に約4mmの縦方向の切開を行います。血管から血液がなくなるまで、100IU / mLのヘパリン溶液で動脈をすすぎます。.
6.左右の吻合
- EJV と CCA をできるだけ近づけて引きます。
- 8-0を使用して、CCAとEJVの左右の吻合にKunlinのテクニック12 を適用します非吸収性縫合糸( 材料表を参照)。最初に血管の後壁を縫合し(図1C)、続いて血管の前壁を縫合します。
注:ウサギのEJV壁は薄いため、手術中は、後で吻合の開存性を損なう可能性のある血管の損傷を防ぐために注意する必要があります。血管吻合の過程で、血栓症を防ぐためにヘパリン溶液(100IU / mL)を繰り返し使用して内腔をすすぐ必要があります。
7.静脈の血管クランプの除去と結紮
- CCAの遠位血管クランプ、EJVの近位血管クランプ、およびCCAの近位血管クランプを順番に取り外します。吻合を通る活発な血流を観察します。
- 先ほど配置した4-0縫合糸を使用してEJVの遠位端を結紮します。EJVの遠位血管クランプを取り外します。
- CCAの周りに配置されていた縫合糸を取り外します(図1D)。
8.皮膚閉鎖と術後ケア
- 術野で重大な出血がないことを確認した後、中断された縫合糸を使用して首の皮膚を閉じます(4-0)。
- ウサギが完全に回復するまでケージに入れます。通常、これには30〜45分かかります。
注:回復が不完全または遅れている場合は、ウサギが手術領域での出血による血行力学的ショックを受けないように注意する必要があります。必要に応じて、術後にスミアンキシンII(0.01 mL / kg)を投与してください。.
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Representative Results
この技術の成功した適用の結果は、ウサギの首の特許AVFです。この研究では、成功を評価するために次の基準を使用しました:(1)血管吻合が完了すると、AVFの静脈振戦に触れることができ、血管雑音を聞くことができます。(2)AVFが確立されてから4週間後、内瘻孔吻合を通る活発な血流は、カラードップラー超音波によって測定できます。(3)AVFが確定してから4週間後、ヘマトキシリン-エオジン(H&E)染色はAVF吻合部で有意な静脈内膜過形成を示す。
全部で36匹の健康なニュージーランドのウサギがこの研究に含まれました。合計で、34匹のウサギがMNTTを使用してすぐに成功したAVFを持っていました。3匹のウサギは術後出血が著しく、1匹は失血により死亡した。残りの2匹のウサギは、出血を止めるために圧迫止血を必要とした。さらに、4匹のウサギが手術後に死亡し、くしゃみ、咳、鼻水、食欲不振、下痢などの一般的な症状がありました。最後に、31匹のウサギが生存し、13匹は手術後4週間で機能的なAVFを示しました。生存率は86.1%でした(図2)。
AVFは、手術の4週間後にカラードップラー超音波検査(CDU)を使用して評価され、AVF吻合を通る活発な血流として定義される開存性を確認しました(図3)。また、吻合部付近の静脈と動脈の両方でらせん状の層流が観察されました(図3)。対側頸部のAVFと正常血管との間の超音波パラメータに関しては、EJVの直径とPSVおよびCCAの直径に有意差があった(表1)。
AVFは術後4週間で取得され、切片化されました。H&E染色は、得られた全ての切片について行った。AVF吻合部位では有意な静脈内膜過形成を認めたが(図4)、吻合部近位EJVでは有意な内膜過形成は認められなかった(図4)。
図1:MNTTを用いてウサギで作成したCCA-EJV AVFです 。 (A)EJVに垂直な方向に沿って2つのトンネルが作られました。(B)CCAが動員された。(C)クンリンの技術を用いて、CCAとEJVの左右の吻合を行った。(D)EJVの遠位端は結紮されており、近位端から特許血流が見えました。略語:CCA =総頸動脈;EJV =外頸静脈;AVF =動静脈瘻;MNTT = 修正されたノータッチ技術。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ウサギの生存曲線。 1匹のウサギは失血のために手術直後に死亡した。残りの4匹のウサギは、手術後3日目、7日目、10日目、26日目に死亡した。最後に、31匹のウサギが手術後4週間で生きていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:AVFのCDU評価アトラス 。 (A)CCAは、一方向の低抵抗血流スペクトル、正常な三相血流の喪失、収縮期ピークの拡大、および豊富な拡張期血流を示しました。(B)EJVは動脈様の低抵抗血流スペクトルを示し、PSVが増加し、スペクトルが拡大した。(C)AVF吻合を通る活発な血流。(D)EJV流出路にらせん状の層流が観察された。略語:AVF =動静脈瘻;CCA =総頸動脈;EJV =外頸静脈;PSV =ピーク収縮期速度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:手術後4週間でのウサギのAVF形態の観察(H&E染色)。 (A)特許AVFによるCCAの有意な内膜過形成は観察されなかった。(B)特許AVFを有する吻合部位のEJVの弾性膜はひどく破壊され、著しい内膜過形成を伴った。厚い過形成性線維組織が弾性膜の内側にはっきりと見え、弾性繊維が減少し断片化しました。(C)吻合の近位EJVには、特許AVFによる有意な内膜過形成はありませんでした。これは、無傷の弾性膜および細くて波状の弾性繊維を示した。略語:AVF =動静脈瘻;CCA =総頸動脈;EJV =外頸静脈。倍率:200倍。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 群 | 外頸静脈 | 総頸動脈 | ||
| 直径(ミリメートル) | PSV (センチメートル/秒) | 直径(ミリメートル) | PSV (センチメートル/秒) | |
| ティッカー | 7.21±1.55 | 79.64± 39.31 | 3.06± 0.32 | 59.38 ± 32.25 |
| 通常の船舶 | 3.13 ± 0.66 | 9.21±2.77 | 2.17 ± 0.41 | 39.02± 11.56 |
| t | 5.413 | 3.996 | 3.779 | 1.329 |
| P | 0.001 | 0.004 | 0.005 | 0.22 |
表1:ウサギの反対側頸部のAVFと正常血管との間の超音波パラメータの比較(n = 5)。 略語:PSV =ピーク収縮期速度。 t検定はデータ分析に使用されます。 P 値が<0.05の場合、2つのグループ間の比較は統計的に有意です。
補足図1:AVF手術における血管吻合モードの模式図。 (A)従来のAVF手術。(B) NTTを使用して作成されたAVF。(C) MNTT を使用して作成された AVF です。略語:AVF =動静脈瘻;NTT = ノータッチテクニック;MNTT = 修正されたノータッチ技術。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:MNTTによる機能的なエンドツーエンド吻合AVF。 略語:AVF =動静脈瘻;MNTT = 修正されたノータッチ技術。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:従来技術を用いて作成したAVFのウサギモデル。 (A)EJVを静脈周囲組織から解剖した。(B)EJVとCCAは一緒に引っ張られました。(C)クンリンの技術を用いて、CCAとEJVの左右の吻合を行った。(D)EJVの遠位端を結紮し、特許血流が近位端を目に見えて通過した。略語:CCA =総頸動脈;EJV =外頸静脈;AVF =動静脈瘻。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在、AVFにはいくつかの動物モデルが利用可能です。このうち、ブタ、ヒツジ、イヌは、主に大型動物モデルとして使用されている13、14、15。使用される小動物モデルには、ウサギ、ラット、およびマウスが含まれる16、17、18。この研究ではニュージーランドのウサギを使用しました。ニュージーランドのウサギはEJVの周りに豊富な静脈組織を持っているため、MNTT法の研究に役立ちます。ニュージーランドのウサギを使用する利点には、簡単な外科手術、便利な給餌、および低コストが含まれます。ただし、血行動態を研究する場合、大型動物モデルはウサギモデルよりも利点があります。
本研究では,MNTTを用いた独自のCCA-EJV AVF法を提案したが,静脈周囲組織を解離したり動脈を切断したりすることなく行う。AVF作成のための機能的な末端から側への吻合19,20は、左右動静脈吻合とそれに続く遠位EJVの結紮によって達成されました。従来の技術(補足図3)と比較して、MNTTによるAVF作成は、静脈周囲組織をより適切に保存しました。動静脈血管吻合中、静脈周囲組織の保存により、静脈周囲組織を引っ張ることによって静脈壁をより完全に露出させることができ、これは血管吻合を助長した。
超音波検査では、吻合近くの静脈と動脈にらせん状の層流が観察され、MNTTがより好ましい血行動態を持っている可能性があり、それが開存性と成熟の優れた速度を説明する可能性があることを示しています21,22。組織学的観察ではAVF吻合部で有意な静脈内膜過形成を認めたが,吻合近位EJVでは有意な内膜過形成を認めなかった.この所見は,この手術手技やらせん状層流による傍吻合部狭窄の改善に関連していると考えられる.
発生する一般的な問題と提案
EJVの壁が薄いため、EJVの損傷を防ぐために血管を吻合する際には穏やかな操作が必要です。EJVの周囲の組織は保存されているので、吻合中に引っ張って血管を広げ、縫合をより助長することができます。しかし、EJVを取り巻く組織の保存は厄介です。静脈切開後、静脈血管からの血液流出を考えると、血管が崩壊し、EJVの収縮を引き起こします。EJV吻合中は、微小血管ピンセットを使用してEJVの周囲組織を引っ張り、静脈壁を完全に露出させる必要があります。さらに、動脈と静脈の間の距離が長い場合、CCAは、2つが互いに接近していることを保証し、したがって吻合を容易にするために、十分な長さを自由に許可する必要があります。8-0血管への損傷を減らすために血管吻合に滅菌血管縫合糸を使用した。
技術的な制限
静脈の準備は依然としてトンネルに沿ってトンネリングとクランプを必要とし、この操作は静脈損傷を引き起こす可能性があります。動脈および静脈の左右吻合を行う前に、動脈および静脈を引っ張ることから血管損傷が生じる可能性があります。開存率は38.2%と他のAVFモデル23,24よりも低かったため、AVF手術後のウサギのケアと検出をさらに改善する必要があります。
技術の応用
MNTTおよび関連する血行動態のメカニズムをさらに研究するには、この技術を検証するための病理学的、分子的、およびゲノム学的研究が必要です。
結論
この研究では、MNTT法を使用してCCA-EJV AVFを作成することに成功しました。手術は簡単で、再現性が高く、成功率が高く、この技術がAVF手術におけるMNTTの適用に関するさらなる研究に理想的である可能性があることを示しています。
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Disclosures
著者らは、この手順で使用される薬物および材料に関連する潜在的な利益相反を持っていません。
Acknowledgments
本研究は、蘇州科学技術計画プロジェクト(SYS2020077)、蘇州ハイテク区医療・健康科学技術計画プロジェクト(2020z001)、蘇州科学技術開発計画プロジェクト-医療・健康科学技術イノベーション(SYK2021030)、南京医科大学科学技術開発基金-一般プロジェクト(NMUB20210253)、蘇州科学技術局の基礎研究プロジェクト応用の助成金によって支援されました。 (No.SYSD2019205、No.SYS2020119)、江蘇省漢方薬科学技術開発計画プロジェクト(No.MS2021098)、文部省産学連携教育プロジェクト(No.202102242003)、江蘇省第6回「333高レベル人材育成」プロジェクト、蘇州科学技術都市病院2022病院レベルの事前研究基金プロジェクト(SZKJCYY2022014)、および蘇州「KeJiaoXingWei」青年科学技術プロジェクト (KJXW2022086)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Depilatory | Fuzhou Feijing Biotechnology Co., Ltd. | PH1877 | |
| Curved hemostatic forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZH131R/RN | |
| Dissecting forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZDO25R/RN | |
| electrical razor | Shenbao Technology Co., Ltd | PGC-660 | |
| Fixed Table | Zhenhua Biomedical Instrument Co., Ltd | ZH-DSB019 | |
| Halsey needleholder | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZM208R/RN | |
| Heparin Dodium Injection | Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. | H32020612 | |
| Medical gauze dressing | Nanchang Kangjie medical hygiene products Co., Ltd | 20172640135 | |
| Micro forceops | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZD275RN/T | |
| Micro needle holder forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF2618RB/T | |
| Micro scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF022T | |
| Non-silk sutures 4-0 | Kollsut Medical Instrument Co., Ltd. | NMB020RRCN26C075-1 | |
| Non-absorbable sutures 8-0 (double needle) | Yangzhou Yuankang Medical Instrument Co., Ltd. | 10299023602 | |
| Povidone iodine solution | Shanghai Likang Disinfection High-tech Co., Ltd. | 310512 | |
| Rinse needle | Jiangsu Tonghui Medical Instrument Co., Ltd | 20180039 | |
| scalpel handle | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | J11030 | |
| Sharp blade | Suzhou Medical Products Factory Co., Ltd. | TY21232001 | |
| Sodium Chloride Injection (100 mL) | Guangdong Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | B21K0904 | |
| Sugical Scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZC120R/RN | |
| Sumianxin II | Jilin Dunhua Shengda Animal Pharmaceutical Co., Ltd. | 20180801 | |
| Syringe with needle?5 mL) | BD medical devices (Shanghai) Co., Ltd | 2006116 | |
| Tiletamine Hydrochloride and Zolazepam Hydrochloride for Injection | Virbac Pet Health, France | 83888204 | |
| Triangle needle | Hangzhou Huawei medical supplies Co., Ltd | 7X17 | |
| Vascular clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF220RN | |
| New Zealand rabbits | Suzhou Huqiao Biological Co., Ltd. | SCXK2020-0001 |
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