Summary
O presente protocolo propõe a criação de uma fístula arteriovenosa em coelhos utilizando uma técnica no-touch modificada. A técnica envolve a anastomose látero-lateral da artéria carótida comum e veia jugular externa sem a dissecção dos tecidos perivenosos ou corte da artéria.
Abstract
A estenose justastomótica é um problema desafiador que frequentemente causa a não maturação e diminui a patência de uma fístula arteriovenosa (FAV). A lesão de veias e artérias durante a operação e alterações hemodinâmicas podem levar à hiperplasia intimal, levando à estenose justastomosótica. Para reduzir a lesão de veias e artérias durante a operação, este estudo propõe uma nova técnica no-touch modificada (MNTT) para a construção de FAV que pode diminuir a taxa de estenose justastomosótica e melhorar a patência da FAV. Para desvendar as alterações hemodinâmicas e os mecanismos do MNTT, este estudo apresentou um procedimento de FAV utilizando essa técnica. Embora esse procedimento seja tecnicamente desafiador, 94,4% de sucesso do procedimento foi alcançado após treinamento adequado. Finalmente, 13 dos 34 coelhos tiveram uma FAV funcional 4 semanas após a cirurgia, levando a uma taxa de perviedade da FAV de 38,2%. Entretanto, com 4 semanas, a sobrevida foi de 86,1%. A ultrassonografia mostrou fluxo sanguíneo ativo através da anastomose de FAV. Além disso, o fluxo espiral laminar foi observado na veia e artéria próximas à anastomose, sugerindo que esta técnica pode melhorar a hemodinâmica da FAV. Na observação histológica, observou-se hiperplasia íntima venosa importante na anastomose com FAV, enquanto não foi observada hiperplasia intimal significativa na veia jugular externa (VVEJ) proximal da anastomose. Esta técnica melhorará a compreensão dos mecanismos subjacentes ao uso de MNTT para a construção de FAV e fornecerá suporte técnico para a otimização adicional da abordagem cirúrgica na construção de FAV.
Introduction
A confecção de fístula arteriovenosa (FAV) é amplamente utilizada na prática clínica para pacientes submetidos à hemodiálise de manutenção (MHD), apresentando maior patência e menos complicações do que um enxerto arteriovenoso (AVG) ou um cateter tunelizado com balonete (TCC)1,2. Embora a FAV seja o acesso vascular preferido, ela não é perfeita e apresenta limitações inerentes. As taxas de perviedade da FAV primária em 1 ano são de apenas 60%-65%, com muitas falhas ocorrendo na região da anastomose próxima 3,4,5.
Os vasos sofrem diferentes graus de dano durante a abordagem cirúrgica tradicional, o que acaba afetando a maturação da FAV. Novas modalidades cirúrgicas, como a técnica no-touch (NTT) (Figura 1 Suplementar) proposta por Hörer et al.6 e a excursão e reimplante da artéria radial (RADAR) propostas por Sadaghianloo et al.7,8 e Bai et al.9, foram desenhadas para diminuir a taxa de estenose justastomosótica e melhorar a patência da fístula modificando a técnica cirúrgica. Embora o efeito do RADAR tenha sido melhor do que o do NTT, observou-se que a estenose arterial de influxo foi mais proeminente com o RADAR. Para reduzir ainda mais a lesão das veias e artérias durante a operação, em 2021, uma nova técnica no-touch modificada (MNTT) foi proposta para criar uma FAV radiocefálica, preservando o tecido perivenoso ao redor da veia cefálica sem cortar a artéria radial (Figura 1 Suplementar e Figura 2 Suplementar). Os resultados preliminares mostraram aumento da perviedade primária, diminuição da estenose justastomótica e ausência de estenosearterial10,11.
Considerando a atual falta de modelos animais de FAV usando MNTT, e para explorar melhor o mecanismo de MNTT em cirurgia de FAV, este estudo introduz um procedimento de FAV da artéria carótida comum (ACC)-veia jugular externa (VVEJ) usando MNTT.
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Protocol
Os procedimentos experimentais com animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina de Nanjing. Coelhos da raça Nova Zelândia com idade de 10 meses (de ambos os sexos; peso corporal, 3,18 ± 0,24 kg) foram utilizados para este estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparo dos animais
- Anestesiar os coelhos utilizando uma injeção intravenosa mista de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam (3 mg/kg) na veia marginal da orelha e uma injeção intramuscular de sumianxina II (0,02 mL/kg) (ver Tabela de Materiais) no músculo dos membros posteriores.
NOTA: Após cerca de 1-3 min, o efeito anestésico estabiliza. Antes de prosseguir, o nível de anestesia deve ser verificado pinçando a pele atrás do pescoço e observando o reflexo corneano. Cloridrato de tiletamina, cloridrato de zolazepam (0,5 mg/kg) e sumianxina II (0,01 mL/kg) podem ser adicionados durante a operação, se necessário. - Coloque o coelho sobre uma mesa fixa (ver Tabela de Materiais) em decúbito dorsal e amarre os membros e incisivos com amarrações.
- Faça a barba no pescoço e na parte superior do peito usando uma navalha elétrica e remova os pelos com creme depilatório animal (consulte a Tabela de Materiais).
- Manter condições estéreis durante a cirurgia, autoclavando o equipamento cirúrgico e limpando a área cirúrgica com solução de iodopovidona.
2. Incisão na pele
- Posicione o coelho com a cabeça em direção ao cirurgião.
- Faça uma incisão longitudinal de ~3 cm entre a mandíbula e a articulação esternoclavicular usando tesoura cirúrgica ou lâmina de bisturi.
3. Preparo da veia jugular externa (VEJ)
- Expor a incisão e identificar a VEJ direita. Certifique-se de que a VEJ e seus tecidos perivasculares sejam claramente visíveis e não dissecados.
NOTA: A VJJ apresenta padrão em "Y" invertido, sendo anastomosado o ramo próximo ao colo medial. - Faça um túnel pelo qual uma pinça vascular possa ser passada (ver Tabela de Materiais) ao longo da direção perpendicular à EJV. Certifique-se de que as distâncias entre as aberturas em ambos os lados do túnel e o EJV sejam de >1 cm.
- Coloque uma pinça vascular ao longo do túnel.
- Fazer outro túnel (o mesmo que no passo 3.2) na EJV distal usando o mesmo método.
NOTA: Certifique-se de que a distância entre os dois túneis é de ≥2 cm. - Aplicar uma sutura 4-0 (ver Tabela de Materiais) e uma pinça vascular ao longo do túnel para controlar o fluxo sanguíneo (Figura 1A).
4. Dissecar e preparar a artéria carótida comum (ACC)
- Use pinças (ver Tabela de Materiais) para explorar a ACC lateral à traqueia e medial ao músculo esternocleidomastoideo.
OBS: A ACC tem sensação pulsátil e corre paralelamente ao nervo cervical. - Dissecar o CCA com um comprimento de cerca de 2 cm.
NOTA: Evitar lesão do nervo vago e seus ramos com um curso arterial profundo. - Coloque um fio de sutura 4-0 ao redor da CCA para controlar o fluxo sanguíneo quando necessário.
- Aplicar pinças vasculares (ver Tabela de Materiais) o mais distal e proximalmente possível (Figura 1B).
5. Preparo da anastomose
- Para flebotomia e anastomose, use microtesouras (ver Tabela de Materiais) para dissecar a parte interna da VEJ (4 mm de comprimento) livre dos tecidos circundantes.
- Faça uma incisão longitudinal de 4 mm de comprimento com microtesoura no meio da veia. Enxaguar a veia com solução de heparina (100 UI/mL) para evitar trombose.
- Realizar incisão longitudinal medindo aproximadamente 4 mm na parede anterior da artéria com lâmina afiada e microtesoura. Enxaguar a artéria com 100 UI/mL de solução de heparina até que o vaso esteja livre de sangue.
6. Anastomose látero-lateral
- Aproxime o EJV e o CCA, o mais próximo possível.
- Aplicar a técnica de Kunlin12 para anastomose látero-lateral da CCA e EJV usando 8-0 suturas inabsorvíveis (ver Tabela de Materiais). Sutura primeiro a parede posterior do vaso (Figura 1C), seguida da parede anterior do vaso.
OBS: Como a parede da VAJ em coelho é fina, deve-se tomar cuidado durante a cirurgia para evitar danos aos vasos que possam comprometer posteriormente a patência da anastomose. Durante o processo de anastomose vascular, solução de heparina (100 UI/mL) deve ser usada repetidamente para enxaguar o lúmen para evitar trombose.
7. Retirada da pinça vascular e ligadura da veia
- Remova o clamp vascular distal da ACC, o pinça vascular proximal da VEJ e, por sua vez, o pinça vascular proximal da ACC. Observe o fluxo sanguíneo ativo através da anastomose.
- Amarrar a extremidade distal da VJJ usando a sutura 4-0 que foi colocada anteriormente. Remova a pinça vascular distal da VEJ.
- Retirar o fio de sutura que foi colocado ao redor da CCA (Figura 1D).
8. Fechamento da pele e cuidados pós-operatórios
- Após não haver sangramento significativo no campo cirúrgico, fechar a pele do pescoço com suturas interrompidas (4-0).
- Coloque o coelho em uma gaiola até que ele se recupere completamente. Normalmente, isso leva de 30 a 45 minutos.
NOTA: Em caso de recuperação incompleta ou tardia, deve-se tomar cuidado para garantir que o coelho não sofra choque hemodinâmico devido a sangramento na área cirúrgica. Se necessário, administrar Sumianxin II (0,01 mL/kg) após a cirurgia.
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Representative Results
O resultado da aplicação bem sucedida desta técnica é uma FAV pérvia no pescoço de coelhos. Este estudo utilizou os seguintes critérios para avaliar o sucesso: (1) quando a anastomose vascular é completada, o tremor venoso da FAV pode ser tocado e o sopro vascular pode ser ouvido; (2) 4 semanas após o estabelecimento da FAV, o fluxo sanguíneo ativo através da anastomose interna da fístula pode ser medido pelo ultrassom com Doppler colorido; (3) 4 semanas após o estabelecimento da FAV, a coloração pela hematoxilina-eosina (H&E) mostra hiperplasia íntima venosa importante na anastomose da FAV.
Ao todo, 36 coelhos saudáveis da raça Nova Zelândia foram incluídos neste estudo. No total, 34 coelhos tiveram uma FAV imediatamente bem-sucedida com o uso do MNTT. Três coelhos apresentaram sangramento pós-operatório significativo e um faleceu por perda sanguínea. Os dois coelhos restantes necessitaram de hemostasia compressiva para estancar o sangramento. Além disso, quatro coelhos morreram após a cirurgia, com sintomas comuns, incluindo espirros, tosse, coriza, anorexia e diarreia. Finalmente, 31 coelhos sobreviveram, e 13 tiveram uma FAV funcional 4 semanas após a cirurgia. A sobrevida foi de 86,1% (Figura 2).
A FAV foi avaliada por meio de ultrassonografia com Doppler colorido (UDC) 4 semanas após a cirurgia para confirmar a perviedade, definida como fluxo sanguíneo ativo através da anastomose da FAV (Figura 3). Além disso, o fluxo espiral laminar foi observado tanto na veia quanto na artéria próximas à anastomose (Figura 3). Em relação aos parâmetros ultrassonográficos entre a FAV e os vasos normais do colo contralateral, houve diferenças significativas no diâmetro e VGV da VJJ e no diâmetro da ACC (Tabela 1).
A FAV foi obtida com 4 semanas de pós-operatório e feita em cortes. A coloração H&E foi realizada em todos os cortes obtidos. Observou-se hiperplasia venosa intimal importante no local da anastomose com FAV (Figura 4), enquanto não foi observada hiperplasia intimal significativa na VVEJ proximal da anastomose (Figura 4).
Figura 1: A FVAE CCA-EJV criada em coelhos utilizando o MNTT. (A) Dois túneis foram feitos no sentido perpendicular ao VEJ. (B) O CCA foi mobilizado. (C) Pela técnica de Kunlin, foi realizada anastomose látero-lateral da CCA e EJV. (D) A extremidade distal da VEJ foi ligada, e o fluxo sanguíneo pérvio era visível através da extremidade proximal. Abreviações: CCA = artéria carótida comum; VJJ = veia jugular externa; FAV = fístula arteriovenosa; MNTT = técnica no-touch modificada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curvas de sobrevida dos coelhos. Um coelho morreu imediatamente após a cirurgia devido à perda de sangue. Os quatro coelhos restantes morreram no 3º, 7º, 10º e 26º dias de pós-operatório. Finalmente, 31 coelhos estavam vivos com 4 semanas de pós-operatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Atlas de avaliação da CDU da FAV . (A) A ACC mostrou espectros de fluxo sanguíneo unidirecional de baixa resistência, perda do fluxo sanguíneo trifásico normal, picos sistólicos aumentados e fluxo sanguíneo diastólico abundante. (B) A VJJ apresentou espectros de fluxo sanguíneo de baixa resistência semelhantes a artérias, com aumento do PSV e espectro alargado. (C) Fluxo sanguíneo ativo através da anastomose de FAV. (D) Observou-se fluxo espiral laminar nas vias de saída da VEJ. Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; ACC = artéria carótida comum; VJJ = veia jugular externa; VPS = pico de velocidade sistólica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Observação da morfologia da FAV de coelhos com 4 semanas de pós-operatório (coloração H&E). (A) Não foi observada hiperplasia intimal significativa da ACC com FAV pérvia. (B) A membrana elástica da VVEJ no local da anastomose com FAV pérvia estava severamente rompida, com hiperplasia intimal importante. Tecidos fibrosos hiperplásicos espessos eram claramente visíveis na face interna das membranas elásticas, com fibras elásticas reduzidas e fragmentadas. (C) A VVEJ proximal da anastomose não apresentava hiperplasia intimal significativa com FAV pérvia. Este mostrou membranas elásticas intactas e fibras elásticas delgadas e onduladas. Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; ACC = artéria carótida comum; VJJ = veia jugular externa. Ampliação: 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupo | Veia jugular externa | Artéria carótida comum | ||
| Diâmetro (mm) | VGV (cm/s) | Diâmetro (mm) | VGV (cm/s) | |
| FAV | 7.21 ± 1.55 | 79,64 ± 39,31 | 3,06 ± 0,32 | 59,38 ± 32,25 |
| Vaso normal | 3,13 ± 0,66 | 9.21 ± 2.77 | 2.17 ± 0.41 | 39.02 ± 11.56 |
| t | 5.413 | 3.996 | 3.779 | 1.329 |
| P | 0.001 | 0.004 | 0.005 | 0.22 |
Tabela 1: Comparação dos parâmetros ultrassonográficos entre a FAV e os vasos normais do colo contralateral em coelhos (n = 5). Abreviação: PSV = pico de velocidade sistólica. O teste t é utilizado para análise dos dados. Quando o valor de P é <0,05, a comparação entre os dois grupos é estatisticamente significativa.
Figura Suplementar 1: Diagrama esquemático dos modos de anastomose vascular na cirurgia de FAV. (A) Cirurgia tradicional de FAV. (B) Uma FAV criada usando a NTT. (C) Uma FAV criada usando o MNTT. Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; NTT = técnica no-touch; MNTT = técnica no-touch modificada. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar: Anastomose funcional término-lateral FAV com o MNTT. Abreviações: FAV = fístula arteriovenosa; MNTT = técnica no-touch modificada. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Modelo de FAV em coelho criado pela técnica convencional. (A) A VEJ foi dissecada do tecido perivenoso. (B) A EJV e a CCA foram reunidas. (C) Utilizando a técnica de Kunlin, foi realizada anastomose látero-lateral da CCA e EJV. (D) A extremidade distal da VEJ foi ligada, e o fluxo sanguíneo pérvio passou visivelmente pela extremidade proximal. Abreviações: CCA = artéria carótida comum; VJJ = veia jugular externa; FAV = fístula arteriovenosa. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Atualmente, vários modelos animais estão disponíveis para FAV. Dentre eles, suínos, ovelhas e cães são os mais utilizados como modelos animais de grande porte13,14,15. Os modelos animais de pequeno porte utilizados incluem coelhos, ratos e camundongos16,17,18. Coelhos da raça Nova Zelândia foram utilizados neste estudo. Coelhos da raça Nova Zelândia possuem abundantes tecidos perivenosos ao redor da VEJ, o que os torna propícios para o estudo do método MNTT. As vantagens do uso de coelhos neozelandeses incluem a operação cirúrgica simples, alimentação conveniente e baixo custo. No entanto, modelos animais de grande porte apresentam benefícios sobre modelos de coelhos quando se estuda hemodinâmica.
Este estudo propôs um procedimento único de FAV CCA-EJV usando MNTT sem a dissecção do tecido perivenoso ou corte da artéria. A anastomose funcionaltérmino-lateral19,20 para confecção de FAV foi realizada por anastomose arteriovenosa látero-lateral seguida da ligadura da VVEJ distal. Comparada às técnicas convencionais (Figura 3 Suplementar), a confecção de FAV com MNTT preservou mais adequadamente o tecido perivenoso. Durante a anastomose vascular arteriovenosa, devido à preservação do tecido perivenoso, a parede venosa poderia ser mais exposta pela tração do tecido perivenoso, o que favoreceu a anastomose vascular.
Na ultrassonografia, foi observado fluxo laminar espiral na veia e artéria próximas à anastomose, indicando que o MNTT pode ter hemodinâmica mais favorável, o que pode explicar os excelentes índices de patência e maturação21,22. Na observação histológica, observou-se hiperplasia íntima venosa importante na anastomose com FAV, enquanto na VVEJ proximal da anastomose não houve hiperplasia intimal significativa. Este achado provavelmente está relacionado à melhora da estenose justa-anastomótica por esta técnica cirúrgica ou ao fluxo laminar espiral.
Problemas comuns encontrados e sugestões
Dada a parede fina do EJV, a operação suave é necessária ao anastomosar os vasos sanguíneos para evitar danos ao EJV. Como o tecido ao redor da VJJ está preservado, ele pode ser tracionado durante a anastomose para desdobrar o vaso e torná-lo mais propício para a sutura. No entanto, a preservação do tecido ao redor da VEJ é incômoda. Após a venotomia, dada a saída de sangue dos vasos venosos, os vasos sanguíneos colapsam e causam retração da VEJ. Durante a anastomose com VJJ, uma pinça microvascular deve ser usada para puxar os tecidos circundantes da VJJ e expor completamente a parede da veia. Além disso, se a distância entre artérias e veias for longa, deve-se permitir que a ACC tenha um comprimento livre o suficiente para garantir que as duas estejam próximas uma da outra e, assim, facilitar a anastomose. Um 8-0 Sutura vascular estéril foi utilizada para a anastomose vascular para reduzir os danos aos vasos.
Limitações técnicas
O preparo da veia ainda requer tunelização e pinçamento ao longo do túnel, e essa manobra pode causar lesão venosa. Antes da realização de uma anastomose látero-lateral arterial e venosa, a lesão vascular pode resultar da tração da artéria e da veia. Como a taxa de perviedade de 38,2% foi menor do que a de outros modelos de FAV23,24, é necessário melhorar ainda mais o cuidado e a detecção de coelhos após a cirurgia de FAV.
Aplicações da técnica
Para aprofundar o estudo dos mecanismos do MNTT e hemodinâmica relacionada, estudos patológicos, moleculares e genômicos são necessários para validar essa técnica.
Conclusão
Uma FAV CCA-EJV foi criada com sucesso neste estudo usando o método MNTT. A operação foi simples, com boa reprodutibilidade e alta taxa de sucesso, indicando que esta técnica tem potencial para ser ideal para novos estudos sobre a aplicação do MNTT na cirurgia de FAV.
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Disclosures
Os autores não apresentam potenciais conflitos de interesse relacionados aos fármacos e materiais utilizados neste procedimento.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subsídios do Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia de Suzhou (SYS2020077), Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia da Zona de Alta Tecnologia de Suzhou (2020z001), Projeto do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia de Suzhou-Inovação em Ciência e Tecnologia Médica e de Saúde (SYK2021030), Projeto Geral do Fundo de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Universidade Médica de Nanjing (NMUB20210253), Departamento de Ciência e Tecnologia de Suzhou da aplicação do projeto de pesquisa básica (No.SYSD2019205, No.SYS2020119), Projeto do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia de Medicina Tradicional Chinesa da Província de Jiangsu (No.MS2021098), o Projeto de Educação Colaborativa de Cooperação Indústria-Universidade do Ministério da Educação (No. 202102242003), o Sexto Projeto "333 Cultivo de Talentos de Alto Nível" na Província de Jiangsu, Projeto de Fundo de Pré-pesquisa de Nível Hospitalar do Hospital Municipal de Ciência e Tecnologia de Suzhou (SZKJCYY2022014) e Projeto de Ciência e Tecnologia Juvenil "KeJiaoXingWei" de Suzhou (KJXW2022086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Depilatory | Fuzhou Feijing Biotechnology Co., Ltd. | PH1877 | |
| Curved hemostatic forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZH131R/RN | |
| Dissecting forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZDO25R/RN | |
| electrical razor | Shenbao Technology Co., Ltd | PGC-660 | |
| Fixed Table | Zhenhua Biomedical Instrument Co., Ltd | ZH-DSB019 | |
| Halsey needleholder | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZM208R/RN | |
| Heparin Dodium Injection | Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd. | H32020612 | |
| Medical gauze dressing | Nanchang Kangjie medical hygiene products Co., Ltd | 20172640135 | |
| Micro forceops | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZD275RN/T | |
| Micro needle holder forceps | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF2618RB/T | |
| Micro scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF022T | |
| Non-silk sutures 4-0 | Kollsut Medical Instrument Co., Ltd. | NMB020RRCN26C075-1 | |
| Non-absorbable sutures 8-0 (double needle) | Yangzhou Yuankang Medical Instrument Co., Ltd. | 10299023602 | |
| Povidone iodine solution | Shanghai Likang Disinfection High-tech Co., Ltd. | 310512 | |
| Rinse needle | Jiangsu Tonghui Medical Instrument Co., Ltd | 20180039 | |
| scalpel handle | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | J11030 | |
| Sharp blade | Suzhou Medical Products Factory Co., Ltd. | TY21232001 | |
| Sodium Chloride Injection (100 mL) | Guangdong Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | B21K0904 | |
| Sugical Scissors | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZC120R/RN | |
| Sumianxin II | Jilin Dunhua Shengda Animal Pharmaceutical Co., Ltd. | 20180801 | |
| Syringe with needle?5 mL) | BD medical devices (Shanghai) Co., Ltd | 2006116 | |
| Tiletamine Hydrochloride and Zolazepam Hydrochloride for Injection | Virbac Pet Health, France | 83888204 | |
| Triangle needle | Hangzhou Huawei medical supplies Co., Ltd | 7X17 | |
| Vascular clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZF220RN | |
| New Zealand rabbits | Suzhou Huqiao Biological Co., Ltd. | SCXK2020-0001 |
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